2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查＊

彭海燕， 崔 岚， 崔仑标， 胡建利， 鲍倡俊， 李 燕， 焦永军， 卞 倩， 史智扬， 周明浩

调查研究

2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查＊

彭海燕， 崔 岚， 崔仑标， 胡建利， 鲍倡俊， 李 燕， 焦永军， 卞 倩， 史智扬， 周明浩△

江苏省疾病预防控制中心，卫生部肠道病原微生物重点实验室，南京 210009

目的 了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况，探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月～12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市／县，采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本，提取总核酸后，应用实时荧光RT－PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测，阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果 采集761只（管）动物，43只（管）检出SFTSV核酸阳性，阳性率为5.65%。采集3 728份标本，阳性49份，阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%），蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份，阳性率为1.23%，不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论 鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV，可能是其自然宿主或传播媒介。

发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）； 实时荧光RT－PCR； 宿主； 媒介； 监测

2009年，中国首次发现了一种可致感染者发热和血小板减少的病毒，感染者可能出现高烧、肠胃道症状、血小板减少、白细胞减少等临床症状，重症者可因多器官损伤致死［1－2］，病死率10%～16%［3］。通过电镜和核酸分析，确认该病毒为布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，被命名为发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV）［2］。布尼亚病毒科约有350个成员，根据其血清学和生化特征，分为布尼亚病毒属、白蛉病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和番茄斑萎病毒属，前4个属可以感染脊椎动物和节肢动物，主要经由节肢动物和鼠类传播，最后1个属已知只感染植物［4－5］。研究发现，发热伴血小板减少综合征疫情主要出现在我国河北、湖北、山东、安徽、江苏、辽宁等省，感染者主要从事农业生产，每年4～10月为发病流行期，部分患者感染前有蜱虫叮咬史［6］，但病毒的自然宿主和传播途径尚不明确。江苏省地处丘陵地区，是发热伴血小板减少综合征的高发地区，为了解自然界动物SFTSV携带状况，以及SFTSV可能的自然疫源地，探讨其宿主和传播媒介，现对江苏省7个市县鼠、牛、羊、刺猬、鸟类、蜱虫等动物携带SFTSV情况进行调查，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2012年3月～12月在江苏省曾报告发热伴血小板减少综合征病例的7个市、县（盱眙、镇江、溧水、溧阳、连云港、宜兴、盐城）采集鼠、牛、羊、刺猬、喜鹊等动物，无菌解剖后分离脏器（心、肝、脾、肺、肾、脑）和血块；采集家养的牛、羊血，并分离血清；采集蜱标本（吸血后的蜱标本为1～5只／管，未吸血的蜱标本为20～50只／管）；所有标本－20℃保存。1.1.2 试剂和仪器 ①试剂:DMEM（Gibco），MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（Roche），SuperScriptⅢPlatinum One－Step qRTPCR Kit（Invitrogen），Vero细胞（中科院上海生命科学研究院细胞库），胎牛血清（Gibco）。②仪器: MagNA Pure LC 2.0全自动核酸提取仪（Roche），Tissuelyser LT组织破碎仪（Qiagen），5424台式冷冻离心机（Eppendorf），Rotor－gene 3000实时荧光定量PCR仪（Qiagen）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及核酸提取 取0.2g左右脏器、血块，吸血蜱虫1只或未吸血蜱虫20～40只置于2.0mL无死角的Eppendorf管中，加入0.6mL预冷的DMEM和1颗无菌钢珠（直径5mm），在组织破碎仪（Qiagen）上以50次／min破碎4min，经10 000r／min 4℃离心3min，取200μL上清，采用MagNA Pure LC全自动核酸提取仪（Roche）提取样品总核酸；剩余上清－80℃保存。取200μL血清标本，提取总核酸。总核酸存放于－80℃待用。

1.2.2 实时荧光RT－PCR法检测病毒核酸 参照文献［6］方法，对样品总核酸进行病毒S基因检测。上游引物SF:5′－GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAA－3′，下游引物SR:5′－TGCCTTCACCAAGACTATCAATGT－3′，探针SP:5′－6FAM－TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC－BHQ2－3′。采用SuperScriptⅢPlatinum One－Step qRT－PCR Kit（Invitrogen），25μL反应体系中:2×reaction mix 12.5μL，SF（10μmol／L）1μL，SR（10μmol／L）1μL，SP（10μmol／L）1μL，H2O 5μL，核酸4μL，taq mix 0.5μL，均匀混合后，在Rotor－gene 3000荧光定量PCR仪上进行检测，反应条件为50℃30 min；94℃2min；94℃15s，60℃1min，在第60s采集FAM通道荧光信号；40个循环。每批反应均设阴性对照（H2O）和阳性对照（分离株稀释液）。当阴、阳性对照均成立，样品扩增曲线呈S级，且扩增阈值（Ct值）＜35判定为阳性。

1.2.3 病毒分离 经实时荧光RT－PCR检测为阳性的标本经抗生素处理后，接种至Vero细胞，37℃孵育1h后用PBS洗涤，于DMEM（含2%FBS）培养液中，37℃、5%CO2的培养箱中培养5～7d，每天观察细胞是否出现病变（CPE），如果无明显CPE则盲传3代后收集培养上清液，离心后提取核酸，用RT－PCR法检测SFTSV的S基因。

2 结果

2.1 总阳性率

检测3 728份标本，阳性49份，阳性率1.31%。其中3 355份为鼠标本（占89.99%），阳性40份，阳性率1.19%；羊标本86份，阳性4份，阳性率4.65%；蜱标本81份（管），阳性4份，阳性率4.94%；牛标本61份，阳性1份，阳性率4.64%；刺猬、鸟类标本分别为110份、35份，均未检出。见表1。

表1 不同动物SFTSV阳性率Table 1 Positive rate of SFTSV among different species of animals

2.2 病毒携带情况

除蜱标本外，本次检测脏器、血块、血清等标本3 647份，检出阳性45份，阳性率为1.23%。其中心脏标本549份，阳性9份，阳性率1.64%；肝脏标本549份，阳性7份，阳性率1.28%；脾脏标本548份，阳性9份，阳性率1.64%；肺标本548份，阳性6份，阳性率1.09%；肾脏标本548份，阳性4份，阳性率0.73%；脑标本532份，阳性5份，阳性率0.94%；血块标本243份，阳性1份，阳性率0.41%；血清标本128份，阳性3份，阳性率2.34%；淋巴结2份，阳性1份。45份阳性标本中:鼠标本40份，包括心脏9份、脾脏8份、肝脏7份、肺6份、脑5份、肾4份、血块1份；其中1只鼠脑、脾标本同为阳性，1只鼠肺、肝、脾脏标本同为阳性，1只鼠脑、心脏标本同为阳性；羊标本4份，包括血清2份、淋巴结和脾各1份，其中1只羊的血清、淋巴结和脾同为阳性；牛标本1份（血清），见表1。

2.3 不同种类动物病毒阳性率

本次调查累计采集来自761只（管）动物，包括鼠526只，刺猬16只，羊7只，牛1头，鸟类（喜鹊、野鸡）共5只，蜱81管，另采集家养牛血清60份，羊血清65份。经实时荧光定量RT－PCR检测，有36只鼠、2头羊、4管蜱、1头牛S基因核酸呈阳性，鸟类、刺猬标本中均未检出；总体检测阳性率为5.65%。不同动物布尼亚病毒阳性率依次为:鼠6.84%（36／526）、蜱4.94%（4／81）、羊2.78%（2／72）、牛1.64%（1／61）。

2.4 不同月份病毒阳性率

采集761只（管）动物标本，8月最多（23.26%）；其次为10月（19.45%）、5月（16.56%）。其中5月检出阳性动物最多（24只），阳性率最高（19.05%）；6月检出阳性动物8只，阳性率为10.00%；8月检出阳性动物8只，阳性率为4.52%；4月检出阳性动物3只，阳性率为8.33%。3 728份标本中，5月阳性率最高（4.01%），其次为4月（3.03%）、6月（1.68%）、8月（1.60%），其他月份无阳性标本检出。见表2。

2.5 病毒分离

经实时荧光RT－PCR检测阳性的标本中，仅1只羊血清及其体表吸血蜱虫的（整虫）研磨液标本中分离出SFTSV毒株，分别命名为Js2012－yang01（羊）和Js2012－pi01（蜱）［7］，其他标本均未分离出毒株。

表2 不同月份SFTSV核酸阳性率（%）Table 2 Positive rate of SFTSV nucleic acid in different months（%）

3 讨论

发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种新发的人兽共患病，目前既无针对性的疫苗，也无特效治疗药物。自2009年首次发现SFTSV病例以来，截止2012年病例报告已涵盖我国16个省（市、自治区），且有向西部、南部扩散的趋势，疾病防控刻不容缓［8］，因此在加大监测力度的同时，研究其致病机制、传播途径、自然宿主都有重要的公共卫生意义。

SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属，其成员多为虫媒病毒，可通过蚊、蜱、白蛉等叮咬传播。SFTSV感染主要发生在丘陵山区，流行期为4～10月，发病高峰为5～7月［9］，与蜱虫活动的高峰时间一致，也与本调查阳性标本出现的时间相一致。Niu等［3］和Zhang等［10］发现SFTSV可以感染羊、牛、蜱虫等动物，但其自然宿主和媒介依然不明。本调查中发现羊及其身上所采吸血的蜱虫均为SFTSV核酸阳性，分离出的2株毒株高度同源，其L、S、M基因的氨基酸同源性为99.7%～100.0%，核酸同源性为99.9%～100.0%；而与国内其他毒株的氨基酸同源性为86.6%～99.5%，核酸同源性为94.7%～99.6%［7］，提示蜱虫可能是SFTSV的传播媒介，而羊可能为天然宿主。

值得注意的是，本次调查中，鼠的阳性率最高，为6.84%，与葛恒明等［11］的报道相当，鼠作为多种出血热病毒的自然宿主，极有可能是SFTSV的自然宿主之一，并在疾病传播中扮演重要的角色。另外，鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑等各器官中均有病毒核酸检出，3只鼠经检测为多器官共同感染，提示SFTSV感染可能存在于多个器官，且通过不同机制攻击不同靶器官而致病。

本调查采集的标本中:血清的阳性率最高（淋巴结标本较少，不做考虑），且从羊血清中分离出1株毒株，其体表蜱虫经研磨后，检出病毒S基因并分离出1株毒株，可能与病毒载量较高有关（上述2标本RT－PCR反应Ct值均＜24）；其他标本Ct值均＞31，病毒载量较低，未能分离出毒株。

本次调查动物标本中SFTSV核酸的总阳性率为5.78%，但血清阳性率仅2.34%，与宫连凤等［12］的报道相当（动物血清2.28%），原因可能是SFTSV感染动物的病毒血症期较短，不容易捕捉。另外，由于本次研究中主要调查的动物为鼠，被捕获收集时已死亡，很难采集到血清进行ELISA检测IgG抗体，而IgG更能反映动物感染SFTSV的情况。因此，建议在未来监测中可采集牛、羊、鸡、狗等动物的血清，同时进行核酸和IgG／IgM的检测，可以更好地了解本地动物感染情况。另外，由于当地温度、湿度、雨水等气候因素的影响，7个地区各月采集的鼠和蜱虫等动物标本数量差距较大，很难系统地比较7个地区各种动物携带布尼亚病毒的情况，因此，本调查重点采取扩大样本采集数量以调查鼠、牛、羊、蜱虫携带SFTSV核酸的情况，旨在为研究SFTSV的传播途径，确定自然宿主提供科学依据，对分析江苏丘陵地区是否可能成为SFTSV疫源地也有重要的意义。

致谢:感谢连云港市疾控中心、盐城市疾控中心、镇江市疾控中心、溧水区疾控中心、溧阳市疾控中心、盱眙市疾控中心、宜兴市疾控中心在样品采集、运输中所做的大量工作。感谢温恬、迟莹、陈银、朱政、戚宇华、李志锋等同志在检测中所做的大量工作。

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（2014－12－12 收稿）

Virus－carrying Status of Animals with Fever and Thrombocytopenia Syndrome in Some Regions of Jiangsu Province during 2012

Peng Haiyan，Cui Lan，Cui Lunbiao et al
Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention，State Key Lab for Enteric Pathogenic Microbiology of Ministry of Health，Nanjing 210009，China

ObjectiveTo investigate the severe fever with thrombocytopenia syndrome virus（SFTSV）－carrying status of animals in some regions of Jiangsu province，and to study its possible media and natural hosts.Methods Specimens from mice，cattle，goats，hedgehogs，birds and ticks were collected from 7cities／counties of Jiangsu province，where SFTSV patients were identified between Mar.to Dec.2012.Total nucleic acid was extracted from the above specimens and subjected to real－time RTPCR for detection of SFTSV S gene.Vero cells were used for virus isolation for positive samples.Results Among 761animals，43were positive for the nucleic acid of SFTSV，resulting in a positive rate of 5.65%.A total of 3 728specimens were collected，among which 49were positive，resulting in a positive rate of 1.31%.Mice had the highest virus－carrying rate among all animals（6.84%），while tick specimens had the highest virus－carrying rate among all specimens（4.94%）.Forty－five of 3 647specimens from which tick specimens were excluded from were found to have the nucleic acid of SFTSV，resulting in a positive rate of 1.23%.Positive rates of different organs in descending order were lymph node（50.00%），serum（2.34%），spleen（1.64%），heart（1.64%），liver（1.28%），lung（1.09%），brain（0.94%），kidney（0.73%），and blood clots（0.41%）.The positive rate of specimens was highest in May（4.01%）.Two SFTSV virus strains were isolated from one goat serum sample and one tick stuck on the skin of above goat.Conclusion Mice，cattle，goats and ticks can carry SFTSV，and they may be the natural hosts or media of SFTSV.

severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus（SFTSV）； real time RT－PCR； host； media；surveillance

R183

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.025

＊“十二五”国家科技重大专项计划（No.2012ZX10004－210－004）；江苏省“十二五”医学重点人才计划（No.H201118）；江苏省科教兴卫工程（No.ZX201109，JKRC2011001）

彭海燕，女，1980年生，助理研究员，理学硕士，E－mail:sun＿tutu＠126.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:zmh＠j scdc.cn