辐射诱发基因组不稳定性肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型的构建＊

原雅艺， 党旭红， 刘红艳， 刘建功， 左雅慧

辐射诱发基因组不稳定性肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型的构建＊

原雅艺， 党旭红， 刘红艳， 刘建功， 左雅慧△

中国辐射防护研究院，太原 030006

目的 构建基因组不稳定细胞Ran基因过表达和RNAi模型，为进一步研究该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法 根据Ran基因信息，以慢病毒载体GV218设计合成2种重组质粒，分别包含Ran基因全长序列以及阴性对照序列；以慢病毒载体GV248设计合成2重组质粒，分别包含Ran基因的小干扰序列以及用于干扰对照的阴性序列。利用Western blot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测；通过转染293T细胞进行慢病毒的包装；利用qPCR和荧光法分别进行滴度的检测；再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL－7702肝细胞，利用qPCR检测Ran基因表达量。结果 测序结果表明重组质粒构建成功，并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为2.0×108TU／mL；RNAi病毒滴度为3.0×108TU／mL。过表达慢病毒能有效地上调Ran基因的表达，过表达效率为85%。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制Ran基因的表达，抑制效率为73%。结论 成功构建基因组不稳定肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型，为进一步研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。

Ran基因； 过表达； RNA干扰； 慢病毒载体

Ran（Ras－related nuclear protein）是原癌基因家族Ras相关的GTP酶（GTPase），参与一系列周期事件的调控，以确保细胞周期顺利进行［1］。有研究显示GTPase Ran能够直接抑制复制起始因子［23］，防止细胞在同一个周期内重复复制，进而维持基因组的稳定性。电离辐射能够诱发基因组不稳定性（radiation－induced genomic instability，RIGI）的发生，辐射诱发的基因组不稳定性是指能使受照细胞获得高于正常情况下积累的稳定性突变的任何一种状态［4］。研究基因组不稳定性对进一步了解辐射致癌的机制具有重要意义［5］。本课题组较早的研究表明电离辐射可诱发人正常肝细胞基因组不稳定的发生［6］，基因芯片检测发现Ran基因在不同剂量照射后的人正常肝细胞HL－7702子代中差异表达显著［7］。迄今为止，有关Ran基因在辐射诱发基因组不稳定性中功能的研究尚未见报道。为了研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定性中的作用，本研究成功构建并包装了针对Ran基因的过表达和RNA干扰（RNA interference，RNAi）重组慢病毒，建立了基因组不稳定细胞有效的Ran基因研究工具，为进一步利用慢病毒研究Ran在辐射诱发的基因组不稳定性中的功能提供研究工具。

1 材料与方法

1.1 菌株与细胞

人正常肝细胞株HL－7702基因组不稳定细胞模型［6］，该细胞由本实验室构建和保存。人胚肾293T细胞、大肠埃希菌菌株DH5α、慢病毒质粒载体GV218、GV248、pHelper1.0质粒、pHelper2.0质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。

1.2 主要试剂

限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和T4DNA连接酶购自NEB公司；高保真Taq酶、dNTP和实时荧光定量PCR试剂SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa公司；超敏ECL化学发光试剂盒购自Amersham公司；BCA蛋白定量试剂盒购自HyClone－Pierce公司；一抗鼠抗人GFP抗体及二抗辣根标记山羊抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司；转染试剂LipofectamineTM2000和逆转录试剂TheroScrit RTTM购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司；RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；细胞DNA含量检测试剂盒和AnnexinⅤ－APC／7－AAD细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。PCR仪购自Applied Biosystems公司；稳压DNA电泳仪购自BioRad公司；凝胶成像仪购自天能公司。

1.3 Ran基因过表达慢病毒的构建

1.3.1 过表达慢病毒载体的制备 针对Ran基因设计并合成引物，Ran上游引物:5′－TGACTTCAACAGCGACACCCA－3′，Ran下游引物:5′－CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA－3′。以人肝细胞基因组cDNA为模板，PCR扩增Ran基因全序列。利用内切酶AgeⅠ酶切GV218载体，及Ran基因扩增产物，酶切产物回收后利用T4DNA连接酶将连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，利用氨苄青霉素进行抗性筛选，挑取阳性转化子菌落重悬于10μL LB（Luria－Bertani）培养液中，取1 μL作为模板，使用通用引物进行菌落PCR反应，并对PCR阳性克隆进行质粒抽提，测序检定。

1.3.2 重组质粒有效性Western blot检测 利用LipofectamineTM2000（Invitrogen）转染试剂将GV218－Ran质粒转染293T细胞。转染36h收集细胞进行Western blot检测。检测流程:细胞经PBS洗涤后加入lysis buffer，裂解破碎，离心收集样品，加入loading buffer变性，SDS－PAGE凝胶进行蛋白电泳，经转膜、封闭、抗体孵育（一抗工作浓度为1∶4 000，二抗工作浓度为1∶4 000），曝光胶片，扫描胶片保存得到数据。

1.3.3 过表达慢病毒载体的包装与滴度检测 取对数生长期的293T细胞，稀释至终浓度为1×105个／mL，接种于细胞培养皿培养。24h观察细胞融合度达到70%～80%时转染。转染前2h，更换培养液为无血清培养液。利用LipofectaminTM2000（Invitrogen）脂质体转染试剂将重组病毒质粒GV218－Ran质粒、pHelper1.0（主要编码病毒的特异性酶、结构蛋白和基因表达的调节因子）、pHelper2.0（主要编码包装病毒时所需的包膜蛋白）共转染293T细胞，转染8h后换为完全培养液，48h后收集细胞上清液（富含慢病毒颗粒）并浓缩。qPCR方法检测滴度。

1.3.4 过表达慢病毒载体的有效性验证 细胞数约为5×104基因组不稳定HL－7702细胞接种于24孔板，37℃培养待融合度达到30%时，重组慢病毒GV218－Ran感染基因组不稳定HL－7702细胞，MOI＝50。分为2组，A组:慢病毒感染组GV218－Ran；B组:阴性慢病毒感染组GV218－NC。感染前使用无血清培养液，感染12h更换20%胎牛血清培养液，待GFP荧光数量表达稳定后收集细胞。提取RNA并反转录成cDNA，采用Real－time PCR的方法检测Ran基因的表达情况，以ΔΔCt法行相对定量分析，统计相对表达丰度。

1.4 Ran基因RNAi慢病毒载体的构建

1.4.1 RNAi慢病毒载体的制备 根据siRNA设计原则，利用Genscript公司在线设计软件（http:／／www.genscript.com／ssl－bin／app／rnai）设计针对Ran基因的RNAi序列，并均通过BLAST（http:／／www.ncbi.Nim.nih.gov／blast.cgi）验证获得5条siRNA序列。选择不对人类任何基因产生干扰的序列（TTCTCCGAACGTGTCACGT）作为阴性对照组。根据siRNA序列合成单链DNA oligo，冷却至室温使其配对形成双链DNA。利用T4DNA连接酶将合成的双链DNA与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的GV248载体连接产生LV－Ran－RNAi重组慢病毒载体。将连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞，利用氨苄青霉素进行抗性筛选，挑取阳性转化子菌落重悬于10μL LB溶液中，取1μL作为模板，使用通用引物进行菌落PCR反应，并对PCR阳性克隆进行质粒抽提，测序鉴定。

1.4.2 RNAi靶序列的筛选 细胞数约为5×104正常HL－7702细胞接种于6孔板，待培养细胞融合度达到30%时，5种重组病毒质粒LV－Ran－RNAi分别感染HL－7702细胞进行感染实验。分为6组: NC组为感染阴性慢病毒组LV－NC－RNAi，KD1～KD5组分别为感染慢病毒组LV－Ran－RNAi－1，LVRan－RNAi－2，LV－Ran－RNAi－3，LV－Ran－RNAi－4和LV－Ran－RNAi－5。感染前使用无血清培养液，于12 h更换20%胎牛血清培养液，待细胞长满培养板收集细胞。提取RNA并反转录成cDNA。采用Realtime PCR的方法检测Ran基因的表达情况。以管家基因GAPDH作为对照，通过检测目的基因的表达量与GAPDH表达量的比值反映基因表达的差异。实验重复3次。

1.4.3 RNAi慢病毒载体的包装及滴度的检测方法同1.3.3过表达慢病毒载体的包装。利用荧光法检测滴度。

1.4.4 RNAi慢病毒载体的有效性验证 方法同1.3.4过表达慢病毒载体的有效性验证。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 Ran基因过表达慢病毒载体的构建结果

2.1.1 过表达慢病毒载体的制备结果 GV218－Ran过表达质粒片段大小为855bp。测序结果显示，插入重组慢病毒质粒载体的Ran基因序列与设计序列一致，没有碱基替换、缺失等，证明慢病毒质粒构建成功。见图1。

图1 过表达慢病毒载体的制备结果Fig.1 Construction of Ran overexpression lentiviral vectors

2.1.2 重组质粒有效性Western blot检测结果Western blot检测，Ran基因融合蛋白表达50kD，电泳条带显示慢病毒载体构建成功。见图2。

2.1.3 过表达慢病毒载体滴度的检测结果 熔解曲线均为单一峰，无非特异性荧光。经计算GV218－Ran过表达慢病毒滴度为2.0×108TU／mL，见图3。

2.1.4 过表达慢病毒载体的有效性验证结果GV218－Ran过表达慢病毒有效上调Ran基因表达，Ran基因的表达强度是感染阴性慢病毒的2.24倍，两者之间差异具有统计学意义（P＜0.01），过表达效率达85%。见图4。

图2 Western blot检测结果Fig.2 Western blot analysis of Ran protein in each group

图3 过表达慢病毒载体滴度的检测结果Fig.3 The titer test result of the Ran overexpression lentiviral vectors

图4 过表达慢病毒载体的有效性验证结果Fig.4 Verification results of the effectiveness of the Ran overexpression lentiviral vectors

2.2 Ran基因RNAi慢病毒载体的构建结果

2.2.1 RNAi慢病毒载体的制备结果 LV－Ran－ RNAi片段大小为490bp，测序结果显示，插入重组慢病毒质粒载体的RNAi序列与设计序列一致，没有碱基替换、缺失等，证明慢病毒质粒构建成功。见图5。

2.2.2 RNAi靶序列的筛选结果 LV－Ran－RNAi与阴性对照组相比可有效地降低Ran基因的表达。干扰组KD1～KD5目的基因表达的抑制率分别为65.7%、52.0%、88.4%、37.3%、26.5%。因此，LV－Ran－RNAi－3（KD3）能最有效抑制Ran基因表达。见图6。

2.2.3 RNAi慢病毒载体滴度的检测结果 LVRan－RNAi－3慢病毒的滴度为3.0×108TU／mL。病毒感染293T细胞的梯度稀释荧光图片见图7。

2.2.4 RNAi慢病毒载体的有效性验证结果 LVRan－RNAi－3慢病毒有效抑制Ran基因表达，Ran基因的表达强度是感染阴性慢病毒的0.52倍，两者之间差异具有统计学意义（P＜0.05），抑制效率为73%。见图8。

图5 RNAi慢病毒载体的制备结果Fig.5 Construction of RNAi lentiviral vectors

图6 RNAi靶序列的筛选结果Fig.6 Screening of recombinant vectors LV－Ran－RNAi

图7 RNAi慢病毒载体滴度的检测结果Fig.7 The titer test results of RNAi lentiviral vectors

图8 RNAi慢病毒载体的有效性验证结果Fig.8 Verification results of the effectiveness of the RNAi lentiviral vectors

3 讨论

Ran与一系列细胞周期事件包括有丝分裂前期纺锤体的组装、染色体的正确定位和平均分配等有关。前期研究推测Ran有可能通过低浓度的Ran－GTP促使MCM连接到Pre－RCs上，启动DNA多次复制，造成受损细胞不能有足够的时间进行修复，导致基因组不稳定性的发生［1，3］。为此，本研究构建了针对基因组不稳定肝细胞的过表达和RNAi慢病毒载体，并对其进行鉴定，为后续进一步进行Ran基因功能方面的研究奠定基础。RNAi是指由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，该技术可特异性抑制特定基因的表达，目前已被广泛应用于探索基因功能等研究领域［8－9］。慢病毒（lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒，并可以在体内较长期的表达且安全性高。GV218与GV248载体引入了嘌呤霉素抗性筛选标记使得重组慢病毒表达GFP蛋白的同时，还具有嘌呤霉素抗性，感染细胞后无需进行流式细胞术分选，只需要加入适量的嘌呤霉素短时间内就可以筛选出阳性细胞。

本研究利用慢病毒载体GV218、GV248，构建了Ran基因的过表达和RNAi重组质粒。通过在RNA水平和蛋白质水平的检测［10］，确认了基因研究工具的有效性，其中5个siRNA片段以KD3片段干扰效果最佳。过表达与RNAi重组质粒分别与pHelper1.0载体及pHelper2.0载体包装成为慢病毒颗粒。其中pHelper1.0载体提供编码病毒所需的结构蛋白和特异性酶；pHelper2.0载体则提供包装病毒所需的包膜蛋白。滴度分别为2.0×108TU／mL、3.0×108TU／mL。Real－time PCR显示，过表达慢病毒能够有效过表达Ran基因，表达强度是对照组的2.24倍，过表达效率达到85%；而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达，表达强度是对照组的0.52倍，RNAi效率为73%。

综上所述，本研究成功构建了基因组不稳定肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型，为进一步研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定性中的作用提供了良好的研究工具。

［1］ 左雅慧.辐射诱发HL－7702细胞基因组不稳定性研究［D］.江苏:苏州大学，2010.

［2］ Blow J J.A new role for ran may be revealed.in ensuring precise duplication of chromosomal DNA［J］.Cell，2003，113（1）: 2－4.

［3］ Yamaguchi R，Newport J.A role for Ran－GTP and Crm1in blocking re－replication［J］.Cell，2003，113（1）:115－125.

［4］ 左雅慧，党旭红.电离辐射诱发的非靶效应及其生物学意义［J］.辐射防护通讯，2010，30（4）:18－22.

［5］ 曹毅，王仲文，沈波.辐射诱导的基因组不稳定性［J］.国外医学·放射医学核医学分册，2003，27（2）:84－86.

［6］ Zuo Y H，Dang X H，Zhang H F，et al.Genomic instability induced by ionizing radiation in human hepatocytes［J］.J Toxicol Environ Health A，2012，75（12）:700－706.

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［8］ 邢婉莹.RNA干扰沉默COL1A1基因在MCF－7细胞中的表达［D］.长春:吉林大学，2009:2

［9］ 赵伯明，杨操.条件性RNA干扰在基因治疗中的研究进展［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（4）:478－481.

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（2014－09－10 收稿）

Construction of Ran Overexpression and RNAi Models of Radiation－induced Genomic Unstable Hepatocytes

Yuan Yayi，Dang Xuhong，Liu Hongyan et al
China Institute for Radiation Protection，Taiyuan 030006，China

ObjectiveTo construct Ran overexpression and RNAi models of genomic unstable cells in an attempt to provide an effective tool for exploring the function of Ran in radiation－induced genomic instability.Methods According to GenBank，a full－length cDNA sequence of Ran and a negative sequence were designed，synthesized，and then inserted into plasmid GV218 lentiviral vector.Moreover，an interfering sequence targeting Ran and a negative sequence were designed，synthesized，and then inserted into plasmid GV248lentiviral vector.Western blot and qPCR were used，respectively，to measure the Ran overexpression and RNAi recombinant plasmids.The viral packaging was performed by transfection into 293Tcells.The virus titer was tested by qPCR and flurometric assay.After infection of radiation－induced genomic unstable HL－7702liver cells with these lentiviruses，the expression of Ran gene was detected by qPCR.Results Sequencing results showed that the recombinant plasmids were successfully constructed and they were efficiently transfected into 293Tcells.The titer of virus was 2.0×108TU／mL in Ran overexpression recombinant plasmid and 3.0×108TU／mL in RNAi recombinant plasmid.Ran was effectively upregulated in cells infected with RNA－overexpressing lentiviral vectors，and the overexpression rate was 85%.RNAi lentiviral vectors could effectively suppress the expression of Ran and the gene silencing rate was 73%.Conclusion Ran overexpression and RNAi models of genomic unstable cells were successfully constructed，which provides an effective tool for studying the function of Ran in radiation－induced genomic instability.

Ran gene； overexpression； RNA interference； lentiviral vector

R349.6

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.012

＊中国核工业集团公司青年科技创新团队项目

原雅艺，女，1988年生，硕士研究生，E－mail:yyy＿yoyo＠sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:yahuiz＠163.com