LY294002对套细胞淋巴瘤增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响＊

黄轶群， 马旭东

LY294002对套细胞淋巴瘤增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响＊

黄轶群， 马旭东△

福建医科大学附属漳州市医院血液科，漳州 363000

目的 观察磷脂酰肌醇3－激酶／丝氨酸苏氨酸激酶（PI3K／Akt）特异性抑制剂LY294002对人套细胞淋巴瘤Jeko－1细胞株细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡变化；Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax、Caspase－3、Caspase－9及信号通路相关蛋白p－Akt、Notch1、HES1的变化。结果 LY294002能明显抑制Jeko－1细胞的增殖；经0、5、10和20μmol／L的LY294002作用24h后，Jeko－1细胞的凋亡率分别为（3.25±1.27）%、（11.34±2.35）%、（22.81±2.74）%、（43.61±3.48）%，差异有统计学意义（P＜0.01）；Western blot检测发现凋亡相关蛋白Bcl－2表达下降，Bax、Caspase－3、Caspase－8、Caspase－9表达上升，PI3K／Akt信号通路相关蛋白p－Akt磷酸化水平下降，Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下降。结论LY294002可以特异性抑制PI3K／Akt信号通路，也可下调Notch1信号通路的活性，抑制Jeko－1细胞增殖，促进细胞凋亡。

LY294002； 磷脂酰肌醇3－激酶／丝氨酸苏氨酸激酶； 套细胞淋巴瘤； Notch1信号通路； 增殖； 凋亡

信号转导通路的异常改变是肿瘤细胞重要的生物学特性，其中Akt信号转导通路在维持细胞恶性生物学特性中起重要作用，而阻断其信号转导通路可诱导机体特异性抗肿瘤效应［1］，研究表明PI3K／Akt通路持续活化是套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）发生发展的分子生物学机制之一，因此抑制该信号通路有望成为MCL治疗的新靶点［2］。而Notch1信号通路也是一种广泛且高度保守的信号通路，在造血细胞的增殖和分化中起重要作用，其异常时可导致血液系统恶性肿瘤［3］。这二者存在广泛的交叉对话。LY294002是PI3K／Akt信号通路特异性阻断剂，目前关于在套细胞淋巴瘤细胞中应用LY294002阻断PI3K／Akt信号转导的研究较少，而阻断PI3K／Akt信号转导后对Notch1信号通路的影响的研究更少。本研究采用LY294002作用于套细胞淋巴瘤Jeko－1细胞株，观察其对套细胞淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响，探讨PI3K／Akt信号对Notch1信号通路的影响，为套细胞淋巴瘤的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

LY294002购自美国Sigma公司；AnnexinⅤ／PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；Bcl－2、Bax、Caspase－3、Caspase－9、p－Akt、Notch1、HES1购自CST公司；β－actin一抗、辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗及Western blot化学发光工作液购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞培养

Jeko－1细胞株购自中国科学院上海细胞库，RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品公司。将细胞株置于含20%胎牛血清和100U／mL青霉素、100U／mL链霉素的RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO2的饱和湿度温箱中培养。收集对数生长期的细胞用于实验。

1.3 MTT法检测LY294002对细胞增殖的影响

取对数生长期的Jeko－1细胞接种于96孔板，每孔200μL，每孔细胞数调整为2×104个，加入LY294002，使其终浓度分别为0、5、10和20μmol／L，另设置阴性对照组，每种浓度设6个复孔。置于培养箱中培养24、48和72h后，加入MTT（5mg／mL）20μL，继续温育4h后，平板1 000r／min离心15min，吸掉180μL上清液，每孔加入180μL DMSO（Sigma公司），然后置于摇床振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上用双波长492nm和630 nm测吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）＝1－（A实验－A空白）／（A对照－A空白）× 100%。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测LY294002对细胞凋亡的影响

取Jeko－1细胞用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液接种于75mL培养瓶，每瓶接种2× 106细胞，细胞密度为2×105／mL，加入LY294002使终浓度为0、5、10和20μmol／L，作用24h后收集处理后细胞。按照BD公司AnnexinⅤ和PI双染试剂盒说明书处理后，立即行流式细胞术检测。

1.5 凋亡相关蛋白及Akt信号通路相关蛋白的Western blot检测

离心收集LY294002终浓度分别为0、5、10、20 μmol／L作用24h的细胞，预冷PBS洗涤2次，吸干洗涤液。按1×106细胞加入100μL裂解液＋1μL酶抑制剂的比例冰上裂解细胞30min，4℃12 000 r／min离心10min，吸取中间清亮层。BCA法进行蛋白定量。以12%的SDS－PAGE电泳分离，电转移法转膜，室温下摇床封闭1h，加入用TBS根据不同的一抗稀释不同的浓度，4℃过夜，TBS洗涤液洗膜后分别放入用TBS按1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温下摇床作用1h，TBS洗涤液洗膜后化学发光法显色，X射线底片曝光，以β－actin为内参照，X射线胶片扫描后，Alpha－DigiDoc图像分析软件进行分析比较。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计处理软件分析。常规进行方差齐性检验，正态性检验。计量资料实验数据以均数±标准差（）表示，进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LY294002抑制Jeko－1细胞增殖

LY294002对Jeko－1细胞增殖的抑制作用呈剂量和时间依赖性，随着剂量的增高和作用时间的延长，对Jeko－1细胞增殖抑制作用越明显（图1）。经0、5、10和20μmol／L的LY294002作用24h后，Jeko－1细胞的增殖抑制率分别为（1.18±0.31）%、（14.45±2.26）%、（27.59±2.35）%、（48.83± 3.24）%，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 LY294002处理后Jeko－1细胞增殖抑制率的变化Fig.1 Changes of inhibition rates of the proliferation of Jeko－1 cells treated with LY294002

2.2 LY294002诱导Jeko－1细胞凋亡

经0、5、10和20μmol／L的LY294002作用24 h后，Jeko－1细胞的凋亡率分别为（3.25±1.27）%、（11.34±2.35）%、（22.81±2.74）%、（43.61±3.48）%，随LY294002浓度的增加而增加，呈浓度依赖性，各浓度组与0μmol／L组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2）。进一步Western blot检测凋亡相关蛋白，发现凋亡抑制蛋白Bcl－2表达减少，促凋亡蛋白Bax、凋亡蛋白Caspase－3、Caspase－9表达增加，呈浓度依赖性，各浓度组与0μmol／L组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.3 LY294002使p－Akt、Notch1、HES1表达下降

Western blot检测PI3K／Akt信号通路相关蛋白p－Akt的表达下降，而Notch1信号通路的Notch1、HES1表达也下降，各浓度组与0μmol／L组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图2 LY294002作用24h后Jeko－1细胞凋亡率的变化Fig.2 Changes of apoptosis rates of Jeko－1cells treated with LY294002for 24h

图3 LY294002处理Jeko－1细胞24h后凋亡相关蛋白的变化Fig.3 Changes of apoptosis－related proteins in Jeko－1cells treated with LY294002for 24h

图4 LY294002处理Jeko－1细胞24h后信号通路相关蛋白的变化Fig.4 Changes of signaling pathway－related proteins in Jeko－1cells treated with LY294002for 24h

3 讨论

MCL是一种较为少见的B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL），约占NHL的3%～10%，目前MCL仍被认为是一种难治的恶性淋巴瘤［4］，因此，探索新的有效治疗途径有重要的临床意义。

研究发现PI3K／Akt信号通路通过磷酸化多种底物，促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，促进血管生成，抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡［5］。Akt是PI3K下游直接的靶蛋白，可直接被PI3K激活，Akt磷酸化后可下调Fas配体（FasL）诱导的凋亡过程，抑制前凋亡蛋白BAD及Caspase－9的活性，活化转录因子NF－κB，促进凋亡抑制基因的转录等，从而达到促进细胞生成、抑制细胞凋亡的作用［6］。

在人类多种常见肿瘤如结直肠癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤中，PI3K／Akt通路存在过度的激活［7－8］。而PI3K／Akt通路为作用靶点的抑制剂已经成为研究热点［9－10］。LY294002是PI3K／Akt通路特异性阻断剂，能和PI3K竞争性结合ATP位点，抑制Akt的磷酸化，抑制PI3K／Akt通路传达，体外实验研究已证实LY294002对PI3K及其下游靶点PKB均有抑制作用，起到抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抗肿瘤细胞转移等作用［11］。

本研究使用人类MCL Jeko－1细胞株为研究模型，采用LY294002特异性阻断PI3K／Akt信号通路，探讨该通路抑制后，淋巴瘤细胞会出现何种生物学改变。研究发现经过LY294002作用Jeko－1细胞24h后，随着LY294002浓度的增加，Jeko－1细胞的增殖率逐渐降低，有时间及浓度的依赖性。流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，发现药物处理组的细胞凋亡率呈现浓度依赖性的升高，有统计学差异，进一步证实了Jeko－1细胞增殖受抑可能与LY294002诱导的Jeko－1细胞凋亡有关。细胞外信号激活细胞内的凋亡酶Caspase是引起细胞凋亡的途径之一［12］，Akt信号通路通过抑制Caspase级联反应对细胞凋亡进行调节［13］。本次实验结果显示，LY294002抑制Akt的磷酸化后，Akt的活性形态下降，可促使凋亡酶proCaspase－3、proCaspase－9剪切为活性亚基Caspase－3、Caspase－9，上调促凋亡蛋白Bax，抑制蛋白Bcl－2的表达，且随着LY294002浓度的增加，此调节作用越明显。

PI3K／Akt与细胞内其它信号通路互相作用，形成复杂的信号网络，精密调控组织细胞的分化、发育、生长等生理过程。Notch1信号通路与PI3K／Akt信号通路之间的关系错综复杂，研究更多认为Notch1信号在AKT／mTOR的上游，活化的Notch1信号能上调许多其它信号通路来促进肿瘤的增殖，而AKT／mTOR信号通路在很多肿瘤中表达上调［14－15］。但是PI3K／Akt信号通路是否可影响Notch1信号通路的活性？本次实验发现LY294002可以抑制Jeko－1细胞Notch1蛋白及其下游的HES1蛋白的表达，提示PI3K／AKT抑制剂也可以下调Notch1信号通路的活性，其机制目前尚未明确。

本实验探讨了PI3K／Akt通路特异性抑制剂LY294002对体外培养MCL Jeko－1细胞株的影响，实验结果显示，在体外环境下LY294002可以抑制Jeko－1细胞的生长、诱导Jeko－1细胞凋亡，其机制可能是通过抑制PI3K／Akt和Notch1通路活性，活化凋亡执行分子Caspase－3实现的，为MCL抗癌药物和基因治疗靶点的选择提供了新的启示和思考。

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（2013－12－11 收稿）

Effects of LY294002 on Proliferation，Apoptosis and Notch1 Signal Pathway of Mantle Cell Lymphoma

Huang Yiqun，Ma Xudong△
Department of Hematology，Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Zhangzhou 363000，China

ObjectiveTo investigate the effects of the specific inhibitor of phosphatidylinositol 3－kinase／Akt（PI3K／Akt），LY294002，on the proliferation and apoptosis of Jeko－1cell line of mantle cell lymphoma（MCL），and on the expressions of Notch1signaling pathway－related proteins.Methods Jeko－1cells were cultured with different concentrations of LY294002.Cell growth was determined by MTT.Cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.The expressions of apoptosis－related proteins（Bcl－2，Bax，Caspase－3and Caspase－9）and Notch1signaling pathway－related proteins（p－Akt，Notch1and HES1）were detected by Western blot.Results LY294002could inhibit the proliferation of Jeko－1cells in a time－and dose－dependent manner.The cell apoptotic rates of Jeko－1cells treated with 0，5，10and 20μmol／L of LY294002for 24hwere（3.25±1.27）%，（11.34± 2.35）%，（22.81±2.74）%and（43.61±3.48）%，respectively，and there were significant differences（P＜0.01）.Western blot showed that the expression of Bcl－2was down－regulated，those of Bax，Caspase－3，Caspase－8and Caspase－9up－regulated，the phosphorylation level of the PI3K／Akt signaling pathway－related protein p－Akt decreased and the expressions of Notch1signaling pathway－related proteins Notch1and HES1reduced.Conclusion LY294002can suppress the growth and induce the apoptosis of Jeko－1cells by specifically inhibiting the PI3K／Akt signaling pathway and down－regulating the activity of Notch1signaling pathway.

LY294002； phosphatidylinositol－3－kinase／Akt（PI3K／Akt）； mantle cell lymphoma（MCL）； Notch1signaling pathway； proliferation； apoptosis

R733.41

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.007

＊福建省引进重大研发机构资助项目（No.2012I2004）

黄轶群，男，1980年生，主治医师，医学硕士，E－mail:nchuangyiqun＠126.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:maxudong005＠hotmail.com