甲泼尼松龙治疗大鼠脊髓损伤的行为学和组织病理学研究

董乐乐 郭鹏年 于泽

包头医学院第一附属医院骨二科，包头014010

甲泼尼松龙治疗大鼠脊髓损伤的行为学和组织病理学研究

董乐乐 郭鹏年 于泽

包头医学院第一附属医院骨二科，包头014010

目的探讨脊髓损伤后应用甲泼尼松龙对大鼠行为学及组织病理学的作用。方法将60只雄性SD大鼠随机分成A、B、C三组，A组为正常对照组，B组为损伤对照组，C组为实验组，每组20只。A组采用单纯全椎板切除，不损伤脊髓；B、C组采用Allen法制作T10脊髓损伤模型。C组首计量以30mg/kg甲泼尼松龙尾静脉注射，余计量以5.4mg/（kg·h）静脉给药，共23 h；A、B组以生理盐水代替甲泼尼松龙尾静脉注射，剂量同C组。术后1 d、1周、2周、4周对三组大鼠后肢运动功能行为进行BBB评分及斜板试验；再在术后1 d和4周各取10只大鼠受损节段脊髓行HE染色及光镜下观察。结果C组大鼠在损伤后各时间点BBB评分和斜板试验角度显著高于B组，差异有统计学意义（P<0.01）。组织病理学显示脊髓损伤后大鼠脊髓组织出血、水肿，空洞形成，神经组织溶解消失，明显脱髓鞘改变。C组病理改变较B组轻。结论甲泼尼松龙可以抑制脊髓损伤后炎症反应，减少组织坏死及空洞范围，改善大鼠运动行为功能。

甲泼尼松龙；脊髓损伤；行为学；组织病理学

随着经济水平和工业化进程发展，脊柱脊髓损伤发生率呈逐年升高趋势，其往往导致损伤节段以下肢体的严重功能障碍。患者及家庭带来身心伤害的同时也给社会造成巨大的经济负担。各国学者历年来在脊髓损伤的预防、治疗和康复方面做了大量研究，目前仍没有行之有效的方法。美国脊髓损伤学会提出早期大剂量应用甲泼尼松龙可以显著控制急性脊髓损伤的炎症反应，减轻继发性损伤，是临床上治疗急性脊髓损伤的首选药物[1]。本实验应用甲泼尼松龙冲击疗法（NASCISⅡ方案[2]）治疗大鼠脊髓损伤，研究大鼠损伤脊髓组织形态学变化和运动功能的恢复情况，为药物临床应用提供新的可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

60只SD大鼠，雄性，体重380～420 g（购于北京维通利华公司）。注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（购自Pfizer Manufacturing Belgium NV公司）。自制改良Allen法脊髓打击器。

1.2 动物分组和模型制作

将60只大鼠随机分为三组。A组：正常对照组；B组：损伤对照组；C组：实验组，每组20只。参照Allen重量垂直打击法制作大鼠急性脊髓损伤模型。10%水合氯醛（0.3ml/100 g）腹腔麻醉，俯卧位固定于手术台上，剪去背毛，以T10棘突为中心取背部后正中切口，将T9～T11椎板轻柔切除，用改良Allen法脊髓打击器以5 cm×10 g的能量垂直打击B组和C组大鼠脊髓。当大鼠尾巴呈痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动，双下肢瘫痪表明为撞击成功。A组实验过程同B、C组一致，切除T9～T11椎板，显露相应阶段脊髓，但不做脊髓撞击。C组大鼠在完成脊髓打击后，立即给予甲泼尼松龙注射冲击治疗，首剂以30mg/kg尾静脉注射甲泼尼松龙，1 h后按5.4mg/（kg·h）静脉给药，共23 h；A、B组在同时间点静脉注射等体积生理盐水。所有动物在安静、通风环境下分笼饲养，环境温度22～24℃，自由饮食，每日定时膀胱区按压排尿4次。

1.3 行为学评分

在术前及术后1 d、1周、2周、4周对每组大鼠行BBB评分[3]和改良Rivlin-Tator斜板试验[4]。评分由三位非本实验人员进行盲法评分，取平均值。

BBB评分法：Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC法，将大鼠放置于2m的圆形平台上，观察其肢态、行走、活动和肢体协调情况，详细记录数据。

改良Rivlin-Tator斜板试验操作方法是：将大鼠放置在有1mm厚度纹理的橡皮斜板上，大鼠身体长轴与斜板纵轴呈垂直位放置，斜板每次升高5°，以大鼠能够停留5 s的最大角度为其功能值。

1.4 脊髓组织取材及病理学观察

伤后1 d、4周每组取10只大鼠，先行行为学评分后再麻醉，立即取出损伤段脊髓2 cm，标记损伤头尾端，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋并切片，片厚5μm，HE染色，在光镜下观察各组大鼠脊髓组织的病理变化。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以±s表示，采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓神经功能的比较

2.1.1 各组大鼠不同时间点BBB评分的比较术前三组大鼠的BBB评分均接近正常值21分，组间比较差异无统计学意义。术后各组内BBB评分随着脊髓功能的恢复呈增高趋势，B、C组BBB评分均明显低于A组，C组BBB评分明显高于B组，差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。

表1 各组大鼠不同时间点BBB评分的比较（分，±s）

表1 各组大鼠不同时间点BBB评分的比较（分，±s）

与A组同时间点比较，*P<0.01；与B组同时间点比较，#P<0.01

组别1 d 1周2周4周A组B组C组19.60±0.97 0.80±0.63*2.40±1.07*#20.05±0.75 2.31±0.52*3.86±0.63*#20.12±0.80 3.14±0.56*6.13±1.17*#20.41±0.87 5.35±1.07*10.87±0.86*#

2.1.2 各组大鼠不同时间点斜板试验角度的比较术前各组大鼠斜板试验均在65°左右，组间比较差异无统计学意义。脊髓损伤1周后，B、C组的临界角度开始上升，随着时间延长，斜板试验角度逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.01）（表2）。

表2 各组大鼠不同时间点斜板试验角度的比较（°，±s）

表2 各组大鼠不同时间点斜板试验角度的比较（°，±s）

与A组同时间点比较，*P<0.01；与B组同时间点比较，#P<0.01

组别1 d 1周2周4周A组B组C组65.1±2.3 29.1±1.8*33.9±2.6*#64.4±1.8 34.2±1.4*39.2±2.5*#63.8±1.65 34.9±2.10*46.5±2.82*#66.5±2.95 37.6±1.91*55.4±2.54*#

2.2 各组大鼠组织病理学改变

HE染色特点：A组各时间点见脊髓形态完好，灰质内可见神经元胞体，神经元及神经轴突结构正常；B组在损伤后脊髓组织水肿、出血，灰白质多灶性出血，神经元肿胀、轮廓不清，部分髓鞘破裂溶解，轴突肿胀，胶质增生；C组脊髓组织结构尚完整，水肿出血较B组轻，胶质纤维增加（图1、图2）。

图1 1 d后脊髓组织HE染色结果（×400）

图2 4周后脊髓组织HE染色结果（×400）

3 讨论

脊髓的各种损伤都会造成脊髓中神经元的变性坏死，由于局部微环境的改变[4-7]不再适合神经元的再生和修复，多导致截瘫等严重并发症，给社会和家庭带来沉重的负担。脊髓损伤后神经功能的丧失主要由原发性损伤和继发性损伤引起[8]。原发性损伤是指机械损伤直接造成的脊髓结构破坏，随后的继发性损伤导致脊髓神经功能的进一步恶化。甲泼尼松龙为人工合成的糖皮质激素，具有抗炎、抗水肿和抗氧化等典型的糖皮质激素作用[9-10]。早期大剂量应用甲泼尼松龙治疗可以有效抑制第二相损伤反应[11-12]。1990年Bracken等[13]报告的NASCISⅡ研究结果显示，急性脊髓损伤后8 h以内用大剂量甲泼尼松龙治疗组与安慰剂组相比，在神经功能的改善方面差异有统计学意义（P＜0.05）。1997年Bracken等[14]报告了NASCISⅢ的研究结果，在脊髓损伤后3～8 h接受甲泼尼松龙冲击治疗的大鼠，在运动功能改善方面，甲泼尼松龙24 h治疗组远不如48 h治疗组。但Huribert[15]提出不同的意见，认为临床中应考虑采用24 h甲泼尼松龙冲击治疗，而不建议使用48 h。本实验早期大剂量应用甲泼尼松龙治疗大鼠急性脊髓损伤，探讨甲泼尼松龙对大鼠损伤脊髓的组织病理学改变和神经功能的影响。

脊髓损伤后的病理改变在伤后1 d已有明显表现，继发反应严重，应用甲泼尼松龙组坏死轻，炎症反应减弱。伤后4周光镜下可见脊髓灰质及周边白质坏死组织降解液化，空洞形成，周围环绕致密的胶质瘢痕，明显脱髓鞘改变。甲泼尼松龙组空洞明显缩小，说明甲泼尼松龙可抑制炎症反应，保护未损伤的少突胶质细胞，组织坏死减少，空洞范围减小，有利于轴突的再生[16-18]。

在行为学上，各组BBB评分和斜板实验角度增长趋势一致，与潘峰等[19]的研究结果相同。甲泼尼松龙实验组在2～4周BBB评分上升较快，此时大鼠可以行走及支撑自体体重，前后肢的协调运动也有恢复，但精细运动的恢复相对来说是一个长期、缓慢的过程。斜板试验角度在甲泼尼松龙实验组2周前上升较缓和，之后升高幅度增大，提示体位控制能力在后期恢复可能要好于前期，可以认为甲泼尼松龙早期治疗可以抑制炎症反应[20]，减少组织坏死及空洞范围，有利于提高行为学评分。

本实验提示脊髓损伤后早期大量应用甲泼尼松龙治疗可减轻炎症反应，在动物行为学及组织病理学上有明显改善，甲泼尼松龙促进脊髓损伤修复的作用机制将在下一步研究中探讨。

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Research on behavioristics and histopathology of methylprednisolone in the treatment of ratw ith spinal cord injury

DONG Le-le GUO Peng-nian YU Ze
Two Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College,Baotou 014010,China

Objective To study effect on behavioristics and histopathology ofmethylprednisolone in the treatment of rat with spinal cord injury.M ethods Sixty SD male ratswere randomly divided into three groups,each group had 20 rats. Group A was normal control group,group B was injury control group,and group C was treatment group.Rats′spine in group A wasmerely respected by total laminectomy without any hurts to its spinal cord.Both group B and C were assigned to be evaluated by using spinal cord injury model(T10)made by Allen method.Rats in group C were injected methylprednisolone which amounted to 30 mg/kg at the beginning.However,the remaining were injected at the amount of 5.4 mg/kg each time,23 hours to the end.Methylprednisolone was replaced by normal saline instead in group A and B,the same dose of group C.After operation of 1 day,1 week,2 weeks and 4 weeks,the hind limbmotor function including BBB score and inclined plane test among three groups were applied.After operation of 1 day and 4 weeks,injured spinal cord of 10 rats were observed undermicroscopy after HE-staining.Results BBB score and inclined plane test angle in group C was significantly higher than that in group B at each time point respectively,with statistical difference (P<0.01).Histopathological study showed that hemorrhage and edema in the spinal cord after injury,and vacuolation in cells,nervous tissuemelted and demyelination changed.Pathological changed of group C was lighter than that in group B.Conclusion Methylprednisolone can restrain inflammatory response of spinal cord injury,reduce range of cavity and tissue necrotic,improve function of behavior.

Methylprednisolone;Spinal cord injury;Behavioristics;Histopathology

R683.2

A

1674-4721（2015）04（c）-0026-04

2015-03-13本文编辑：李亚聪）

内蒙古自治区自然科学基金资助项目（2009MS1116）