系统性红斑狼疮患者外周血Th17与Treg细胞及相关细胞因子表达的研究

李 志，杨婷婷，李文哲，王 青，王 波，徐维家

（1.大连市中心医院检验科，辽宁大连116033；2.大连医科大学基础医学院，辽宁大连116044）

系统性红斑狼疮患者外周血Th17与Treg细胞及相关细胞因子表达的研究

李 志1，杨婷婷1，李文哲2，王 青1，王 波1，徐维家1

（1.大连市中心医院检验科，辽宁大连116033；2.大连医科大学基础医学院，辽宁大连116044）

目的检测系统性红斑狼疮（SLE）患者辅助性T细胞17（Th17）和调节性T细胞（Treg）与其相关细胞因子在外周血中的表达。方法选择38例SLE患者，根据病情严重程度SLEDAI评分进行分组；使用流式细胞仪检测38例SLE患者和对照组Th17和Treg细胞的数量；酶联免疫吸附法（ELISA）检测血浆中相关细胞因子的表达。结果SLE患者外周血中Th17细胞及其相关细胞因子IL－17、IL－23和IL－6显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且疾病活动组的表达也显著高于非活动组（P＜0.05）；此外与对照组相比，SLE非活动组Treg的表达降低（P＜0.05），并且疾病活动组的表达也低于非活动组（P＜0.05）；SLE活动组细胞因子TGF－β的表达高于非活动组和对照组（P＜0.05）。结论SLE患者外周血中Th17细胞及其相关细胞因子表达水平显著升高，而Treg细胞的表达降低，两者平衡被打破，提示Th17／Treg的失衡可能在SLE发病机制中发挥重要作用。

系统性红斑狼疮；辅助性T细胞17；调节性T细胞；白细胞介素17；白细胞介素23；白细胞介素6；生长转化因子－β

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0253）

系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见的自身免疫性疾病，可累及多系统多器官。T淋巴细胞介导的自免反应在SLE病程过程中起了重要的作用。在不同的细胞环境中CD4＋T细胞可分化为不同的T淋巴细胞亚群，其中辅助性T细胞17（Th17）和调节性T细胞（Treg）在SLE发病过程中尤为重要［1］。本研究通过检测SLE患者外周血Th17、Treg两种T细胞亚群与其相关因子IL－17和TGF－β等的表达水平，探讨Th17与Treg细胞平衡及其在SLE发病中的意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取患者组为大连市中心医院2011年5月至2012年5月的门诊和住院SLE患者共38例，其中男5例，女33例，年龄22－56岁，平均（36.2± 12.51）岁；SLE的诊断符合美国风湿病学会1997年制定的SLE分类诊断标准［2］，平均病程（5.14± 4.56）。根据SLEDAI评分将患者分为活动组（≥10分）22例和非活动组（＜10分）16例。21名健康者作为对照组，平均年龄（40.35±10.21）岁。

1.2 主要试剂

CD3－FITC，CD4－PC5，CD4－FITC，CD25－PC5单抗、固定破膜剂IntraPrepTM购自美国Beckman公司；PE－IL－17，PE－Foxp3单抗及对照购自美国eBioscience公司；Foxp3Perm Buffer（10×）、Foxp3 Fix／Perm Buffer（4×）购自BioLegend公司；刺激剂PMA、离子霉素Ionomycin、莫能霉素monensin购自美国Sigma公司；IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的ELISA试剂盒购自美国R＆D公司。

1.3 标本采集和处理

受检者清晨空腹静脉采血两份于肝素钠抗凝管中：其中一份用于Treg细胞的检测和密度梯度离心法Ficoll分离PBMCs后对Th17细胞的检测；另一份离心保留血清用于ELISA试验检测细胞因子。

1.4 实验方法

1.4.1 Th17细胞和Treg细胞的流式检测

将分离出的外周血单核细胞及对照组加入CD3和CD4的酶标抗体进行表面标记，用于Th17细胞的标记；将标记后的PBMCs标本用RPMI－1640培养液洗涤，并加入到特殊培养液中（含新生牛血清、刺激剂等），放入37°温箱孵育18－20h。培养后的细胞及对照组进行固定破膜之后加入酶标IL－17抗体和对照抗体，避光孵育30min后PBS洗涤。

取外周全血200μl及对照组加入CD4和CD25的单抗，用于Treg细胞的标记；将标记好的全血样本用PBS洗涤后，进行固定破膜。最后加入酶标FoxP3抗体进行细胞内细胞因子的标记，对照管加入FoxP3对照抗体，孵育30min。最后，应用流式细胞仪测定标记细胞的荧光强度。

1.4.2 ELISA检测血清中IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的含量

对于IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β的测定要严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 数据处理

用SPSS19.0统计软件进行分析，数据以“均数±标准差（s）”表示，两组间数据用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血中Th17、Treg细胞的表达

与对照组相比，SLE患者Th17细胞的比例显著升高（P＜0.05），且疾病活动组Th17细胞的表达也高于非活动组（P＜0.05）；与对照组相比，SLE非活动组和活动组Treg的表达降低（P＜0.05），且活动组Treg的表达也明显低于非活动组（P＜0.05），结果见表1。

表1 各组Th17及Treg细胞的表达

2.2 各组IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β水平的比较

SLE患者血清中IL－17、IL－23和IL－6的浓度较对照组显著性升高（P＜0.05），且疾病活动组较非活动组也显著升高（P＜0.05）；SLE活动组TGF－β的浓度高于非活动组和对照组（P＜0.05），而对照组与非活动组TGF－β的表达无显著差异（P＞0.05），结果见表2。

表2 各组血清中IL－17、IL－23、IL－6和TGF－β水平的比较

3 讨论

初始T淋巴细胞在不同的刺激条件下可分化为不同的T细胞亚群，各亚群发挥着各自的功能维持着免疫的平衡与稳定，既相互共生又相互抑制。系统性红斑狼疮患者自身免疫耐受被破坏，T细胞介导的自身免疫反应在SLE发病过程中发挥重要作用［3］。

初始T细胞在IL－6和TGF－β的共同作用下分化发育成Th17细胞［4］，研究发现Th17细胞与细胞因子IL－17、IL－6、IL－23等能够参与自免疾病和炎症反应。本研究显示SLE患者Th17细胞高于健康对照组，且Th17的升高与疾病活动性相关，提示Th17与SLE的发生发展密切相关。IL－17通过诱导白介素－6，TNF－α等其他致炎因子的表达来介导炎症细胞到局部的浸润进而导致组织损伤。此外，白介素－17也参与了树突状细胞及中性粒细胞的成熟分化及趋化过程。除了IL－17外，Th17细胞还能分泌IL－17F，IL－21，IL－22等。此外，IL－23主要由活化的抗原递呈细胞产生，不仅可以促进记忆性T细胞分泌IL－17，而且还能稳定扩增Th17细胞表型［1］，是IL－17直接有力的调节因子，在促进和维持Th17细胞分化方面发挥重要作用［5］。本实验证实SLE患者IL－17、IL－23和IL－6的表达均显著升高，推测Th17细胞相关细胞因子可能参与了SLE的发病过程。

但是如果仅存在生长转化因子－β时，初始T细胞将不会分化为Th17而是向调节T细胞转化并分泌TGF－β，并对免疫应答发挥负调控作用。已经证实SLE患者体内存在Treg细胞的缺陷，这一缺陷干扰了SLE患者免疫调节功能，丧失了对正常组织的免疫耐受，从而导致疾病的发生［6］，与本实验结果相一致。TGF－β可抑制巨噬细胞和淋巴细胞等细胞的免疫功能，发挥免疫负调控作用，从而能够维持免疫耐受的稳定状态［7］。本实验证实TGF－β在SLE患者体内表达减少，致使机体内的淋巴细胞的分化异常，产生多种自身抗体，可能是SLE发病的诱因之一。

健康的组织中Th17和Treg细胞并存、在分化过程中相互调节，在稳定状态下，免疫系统未被激活，TGF－β促进Treg细胞的产生，Treg细胞以主动方式调控机体的免疫应答，使免疫系统既能清除异物抗原，又不会引起机体损伤而维持机体稳定。当机体受到病原体入侵时，内源性TGF－β与IL－6促进Th17的分化，而后随着IL－6的水平降低，TGF－β又通过扩增维持调节T细胞的功能［1］。在许多的自身免疫疾病中，过度分化的致病T细胞和功能受损的调节T细胞打破了正常的免疫平衡状态，使免疫系统向着促炎的状态发展从而导致疾病的发生。红斑狼疮患者体内Th17细胞及IL－6和IL－17，IL－23等相关因子分泌明显提高［8］，IL－17及B细胞激活因子共同作用促进B细胞产生致病的自身抗体。同时因为Treg细胞减少和Th17细胞的高表达而导致的Th17／Treg比例失调可作为SLE疾病的活动指数［9］。

可见Th17细胞和Treg细胞的分化发育相互制约，这依赖于各种致炎和抗炎因子的相互作用，二者平衡被打破时可导致SLE的发病。因此通过抑制致炎的Th17细胞的功能和分化并促进Treg细胞的数量及功能来调节两者的比例使其达到平衡状态对疾病的恢复可能是有益的，本实验结果可能为SLE的发病机制研究及靶向治疗提供依据。

［1］闫成兰，张少然，陈俊伟.系统性红斑狼疮Th17／调节性T细胞平衡［J］.中国药物与临床，2012，12（3）：349.

［2］Hochberg MC.Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，1997，40（9）：1725.

［3］徐维家，李 志，杨婷婷，等.系统性红斑狼疮患者Th17和Th1细胞及其细胞因子水平的变化及临床意义［J］.检验医学，2013，28（5）：396.

［4］Kimura A，Naka T，Kishimoto T.IL－6－dependent and independent pathways in the development of interleukin 17－producing T helper cells［J］.PNAS，2007，104（29）：12099.

［5］Wilson NJ，Boniface K，Chan JR，et al.Development，cytokine profile and function of human interleukin－17－producing helper T cells［J］.Nat Immunol，2007，8（9）：950.

［6］尤海燕，陈军浩，巢秀琴.系统性红斑狼疮患者外周血天然调节性T细胞检测及临床意义［J］.检验医学，2008，23（1）：5.

［7］陈俊伟，张少然，闫成兰，等.T辅助细胞亚型细胞相关因子在类风湿关节炎发病中的作用［J］.中国药物与临床，2012，12（4）：420.

［8］Doreau A，Belot A，Bastid J，et al.Interleukin 17acts in synergy with B cell－activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus［J］.Nat Immunol，2009，10（7）：778.

［9］Q.Xing，H.Su，J.Cui，et al.Elevated Th17cells are accompanied by FoxP3＋Treg cells decrease in patients with lupus nephritis［J］.Rheumatology International，2012，32（4）：949.

Studies on the population of Th17 and Treg cells and the expression of the correlated cytokines in SLE patients

LI Zhi1，

YANG Ting－ting1，LI Wen－zhe2，et al.（1.Department of Clinical Laboratory，Dalian Municipal Central Hospital，Dalian 116033，China；2.School of Basic Medical Sciences，Dalian Medical University，Dalian Liaoning116044，China）

ObjectiveTo investigate the population of T helper 17cells and regulatory T cell in peripheral blood of system lupus erythematosus（SLE）patientsMethodsThirty－eigth patients with SLE were recruited，grouping according to SLE disease activity index score（SLEDAI）.The percentages of Th17and Treg cells were analysed by flow cytometric.Concentrations of Interleukin（IL）－17，IL－23，IL－6，transforming growth factor－βin plasma were used by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsThe percent of Th17and IL－17，IL－23and IL－6in SLE patients was significantly increased than that of normal controls（P＜0.05），and it was different between the high active and inactive group（P＜0.05）.The population of Treg cells in the patients group was significantly lower than normal controls（P＜0.05）；Concentrations of TGF－βin SLE active group were lower than inactive group and controls（P＜0.05）.ConclusionThe study suggests that Th17and Treg cells may play an important role in the pathogenesis of SLE.

System lupus erythematosus；T helper 17；Regulatory T cell；Interleukin（IL）－17；Interleukin（IL）－23；Interleukin（IL）－6；Transforming growth factor（TGF－β）

R593.24＋1

A

李志（1971－），男，硕士，主任技师，主要从事自身免疫及分子生物学研究。

2014－01－23）

1007－4287（2015）02－0253－03

大连市医药卫生科学研究项目