有机改良水稻土中胡敏酸组分及其特性

Prabhat Pramanik Pil Joo Kim 著 文 静 林启美 * 译

(1 韩国庆尚大学应用生命科学部 晋州 660-701 2 中国农业大学资源与环境学院 北京 100193)

全球土壤碳库分别是大气碳库和生物碳库的3.3倍和4.5倍。土壤有机质(SOM)是农业生态系统基本组成要素，在土壤物理、化学和生物学等多种特性中起着重要的作用。有机碳约占全球土壤碳库的62%，其中至少50%为化学稳定形态的腐殖物质。可提取腐殖质在自然界中普遍存在，并在可持续农业中起着重要作用。一般来说，腐殖质为无结晶、褐色至黑色、酸性的多分散性物质，分子量在几百至几千之间。根据其溶解性，腐殖质可分为胡敏酸(HAs)和富里酸(FAs)。胡敏酸是土壤有机质最稳定的组分，是有机残体经过微生物分解的产物。一些研究者利用精密仪器，如傅里叶变换红外光谱(FTIR)和核磁共振(NMR)，研究其化学特性。经研究发现，胡敏酸由富含多种官能团的有机物质组成，包括芳香族、脂肪族、酚类和对苯二酚类化合物，这些物质含量和比例因腐殖化程度而异。根据分子大小，胡敏酸可分为高分子量和低分子量两大组分。也可根据胡敏酸的疏水性、大小及其依赖于电荷运动性的差异进行分组。据报道，作物残茬的腐殖化作用，可提高羧基碳、烃基碳和芳香族碳(主要是酚类官能团)含量，减少O-烷基碳含量。一般说来，腐殖化程度较高的有机物，更容易与土壤胶体上的电荷位点结合，形成良好的团粒结构，从而改善土壤物理、化学和生物学性质，提高土壤肥力。然而，人们在分析胡敏酸组分特征之前，并没有根据其腐殖化程度的差异对其进行分组。本研究假设由于初始底物及分解过程存在差异，胡敏酸的腐殖化程度有差异，以此为依据，建立一种胡敏酸分组的新方法，并以施用有机改良剂的水稻土作参比，测定各组分的相对浓度。

1 材料与方法

1.1 胡敏酸提取

本研究利用以前试验所采的水稻土样品，对提取方法进行标准化检验。该土壤为火山灰土，有机碳含量10.64±0.95 mg/g，胡敏酸含量0.26±0.09 mg/g。用以下方法提取胡敏酸：在氮气条件下，一定量土壤样品在NaOH(0.1 mol/L)-NaCl(30 g/L)溶液中振荡过夜，离心后收集上清液，沉降物用NaOH-NaCl溶液清洗两次，将洗涤液与上清液合并。用6 N盐酸溶液调节混合液pH至1.5～2.0，析出沉淀为胡敏酸，上清液为富里酸。胡敏酸在HCl-HF溶液中震荡(体积比1∶1)，去除无机物，再溶解于NaOH-NaCl溶液中用于胡敏酸分组。

1.2 胡敏酸分组

根据极性的差异对胡敏酸进行分组，基本原理是：通过改变溶液的极性改变介电点，使不同的组分分离出来。将150 mg的胡敏酸沉淀物溶于12 mL溶剂中，加入3 mL无水乙醇，充分混合，使乙醇浓度为200 mL/L，4 ℃下静置过夜，离心，所得沉降物即为200P组分。冲洗沉降物，将冲洗液和离心的上清液混合，加入适量无水乙醇，使乙醇浓度为300 mL/L，4 ℃下静置过夜，离心，沉降物即为300P组分。重复上述步骤，调节乙醇浓度为400 mL/L和800 mL/L，分别获得400P和800P组分(图1)。而溶于800 mL/L乙醇溶液的胡敏酸为800S组分。所有组分测定质量后，溶于NaOH-NaCl溶液中，将浓度调节为2.33 mg/mL待用。

图1 本研究所收集的胡敏酸各组分(浓度为2.33 mg/mL)Fig.1 Humic acid fractions (concentration: 2.33 mg/mL)collected during this study

1.3 胡敏酸组分的化学特征

用重铬酸钾氧化法测定各组分有机碳含量。用Varian紫外分光光度计(Cary 50 Conc)测定在400 nm和600 nm下的吸光度。将1 mg胡敏酸粉末与50 mg光谱级溴化钾混成小球，用分辨率为4 cm-1的Perkin-Elmer 1725x FTIR光谱仪测定。

1.4 水稻土胡敏酸分析

1.4.1 水稻田间试验

试验在韩国庆尚大学的一个农场进行，供试土壤为Andiaquands，粘壤质，排水较差，测得有机碳和p H分别是11.79±1.51 m g/g和6.32±0.43(水土比为1∶5)。试验设置3个处理：分别为对照、风干牛粪(简称牛粪)和发酵牛粪(简称堆肥)，牛粪和堆肥的用量均为2 t/hm2，小区面积100 m2(10 m×10 m)，共计3次重复，小区随机排列。牛粪和堆肥的总有机碳含量分别是43.8±4.2 mg/g和29.4±3.8 mg/g，胡敏酸含量分别是0.85±0.09 mg/g和1.73±0.07 mg/g。所有处理采用推荐化肥施入量，即尿素90 kg/hm2，过磷酸钙45 kg/hm2，氯化钾58 kg/hm2。供试水稻为“Dongjinbyeo”(日本)，30天的秧苗移栽至淹水稻田，试验期间稻田水面维持在5～7 cm。

1.4.2 胡敏酸分组及其化学特征

在水稻收获期采集土壤样品，采用上述方法提取和分离胡敏酸各组分。用GC-8000 TOP-Voyager气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)与CDS-1500热裂解炉结合，分析胡敏酸各组分的化学特征。称取约2.0 mg的胡敏酸样品与过量的N，O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)混合进行硅烷化作用，并加入三甲基氯硅烷(TMCS)作为催化剂(BSTFA∶TMCS=5∶1,v/v)。将反应产物注入到CDS-2000热解探头中，以10 ℃/min的速度从70 ℃升至610 ℃，在610 ℃保持10 s。以氦气作载气，将热解产物带入熔融硅衬里的DB-5 ms柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm，J&W)中，柱温起初控制在50 ℃保持3 min，然后以7.5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，最后在300 ℃保持2 min。离子源在70 eV和40～500 m/Z质量检测范围内运行(图2)。

图2 胡敏酸各组分的有机碳含量和吸光度Fig.2 Organic C contents and spectrophotometric analysis data of HA fractions

1.5 数据分析

所有数据为3次重复的平均值，用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 胡敏酸组分及其化学特征

采用标准方法，根据在不同极性溶液中的沉淀反应，从供试土壤分离得到200P～800P 7个组分，可溶性组分(800S)为第8个组分，各组分溶解在溶剂中，浓度均为2.33 mg/mL，根据颜色可以辨别出这些组分的差异(图1)。从200P到800S，总有机碳含量逐渐降低，在47%～63%之间，300P最高为63%(图2)。A600/C比值的变化趋势与总有机碳含量相同，虽然400P的比值最高，但与200P，300P并没有显著性差异，相比而言，700P，800P和800S的A600/C比值显著降低(P≤0.05)。

红外光谱数据显示，不同胡敏酸组分含有的官能团存在差异。加入乙醇越少(即极性越小)，酚类、杂环、羧酸、酮和不饱和化合物沉淀析出越多，浓度相对较高，尤其是300P组分，这些化合物的浓度最高(表1)，而饱和碳化合物、醚和脂肪族羟基官能团在800P和800S组分中更加丰富。

2.2 水稻土中总胡敏酸及各组分的含量

不同处理水稻土胡敏酸浓度存在显著差异(P≤0.05)见图3a。与对照相比，牛粪和堆肥显著提高了胡敏酸浓度，从对照的0.13±0.02 mg/g分别提高至0.27±0.03 mg/g和0.33±0.03 mg/g。胡敏酸各组分的浓度受有机物添加模式的影响。不考虑有机改良剂的性质，300P组分的浓度最高，占总胡敏酸34%～47%(图3b)，有机改良剂主要是增加了300P组分的相对浓度。不同处理中，堆肥处理300P浓度最高(相对比例为47%)，显著高于牛粪处理(相对比例为35%)。400P(9%～26%)和600P(7%～11%)的相对浓度高于余下组分(<8%)，显然余下组分含量很低，且之间的差异很小。

表1 胡敏酸不同官能团红外光谱峰积分面积Tab.1 Integrated peak areas of the FTIR spectra of HAs corresponding to different functional groups

图3 不同处理水稻土的胡敏酸各组分含量的差异Fig.3 Changes in HA fractions in rice paddy soils as affected by different treatments

2.3300 P组分的化学特征

裂解气质联机分析结果显示，300P组分主要裂解产物包括吡啶、甲基酮、乙胺、2-硫代-3-甲基戊酮、3-羟基-2-烯、氮杂苯嗪、连氮或苄氧基胺，其浓度差异很大(表2)。其中，甲基酮(41.43%)和3-羟基-2-烯(48.20%)约占90%。

表2 裂解气质联机检测的300P组分中的化合物Tab.2 Compounds identi fi ed from 300P fractions by Py-GC-MS

3 讨论

腐殖质是地球表面分布最广泛且最稳定的有机物质，胡敏酸是由多种含碳的大分子化合物构成的复杂混合物，是有机残体在异养微生物作用下，经过一系列生物化学反应形成的产物。将胡敏酸分组对于理解其与各种有机化合物和无机化合物之间的相互作用，以及了解胡敏酸在自然环境和农田生态系统中的作用等，都具有十分重要的意义。

胡敏酸在环境中普遍存在，因它的聚合电解质特性，在平衡土壤养分的有效性和一些生物化学过程时，是一种重要的胶体和吸附剂。分子量大小是影响胡敏酸组分活性的重要因素之一，但稳定的形态和复杂的结构限制了对胡敏酸组分的分离，也限制了对胡敏酸组分特性的分析。最近，人们陆续将一些成熟的高新技术应用在胡敏酸特性的研究上，如超滤作用技术、高效能排阻色谱柱技术(HPSEC)、针铁矿顺序吸附技术、酸沉淀核磁共振波谱分析技术等。

本研究根据极性的变化，也就是基于腐殖化程度的差异，将胡敏酸分为8个组分，全部罗列出即：200 P、300 P、400P、500 P、600P、700 P、800P和800S。显然，有机质的腐殖化导致含碳有机物质缩合，腐殖物质含碳量提高，因此将总有机C含量和A600/C比值用作腐殖化程度的指标。本研究用A600/C比值来评估胡敏酸各组分的腐殖化程度，此处A600为0.1 M溶液在600 nm下的吸光度；C为0.1 M的溶液碳含量。结果表明，根据极性的变化和腐殖化程度的差异，土壤腐殖物质可分为多个组分，其中200P组分、300P组分和400P组分有机碳含量和A600/C比值较高，表明这些组分有机碳化合物缩合程度及腐殖化程度较高。显然，腐殖化程度较高的化合物，由于在极性溶液中变化较少，更容易沉淀下来。在Watanabe等的研究也观察到加入少量丙酮，会导致更多的腐殖物质发生沉淀。

腐殖化过程中，有机质常发生生物化学氧化作用。堆肥是一项成熟的技术，通过腐殖化作用将有机废弃物转化为营养丰富的土壤改良剂。堆肥中胡敏酸组分的含量和质量，可用作堆肥熟化度和化学稳定性的重要指标，也是堆肥安全利用与应用效果的保证。据Romero等的研究报道，堆肥过程能够改变类胡敏酸物质的化学特性和结构，导致脂肪、多肽和碳水化合物减少，而含氧官能团和酸性官能团物质增加，最终与典型土壤胡敏酸相似。腐殖化过程能促使脂肪族或芳香族羧酸官能团和酚类化合物的形成，如-COOH、酮基>C=O、芳香C=C(波动范围1771～1500 cm-1)和芳香族CH(波动范围3002～3820 cm-1)。在200P组分，300P组分和400P组分中这些官能团含量较高，表明施用堆肥的土壤，其胡敏酸组分中含有较多的腐殖物质。

本研究结果显示，胡敏酸中腐殖化程度较高的组分，由于在极性溶液中变化较少，更容易发生沉淀。这就意味着随着腐殖化程度的提高，由于-COOH基团和酚类化合物的存在，会导致负电荷增加，极性增强。施用有机改良剂的水稻土，胡敏酸8个组分中200P组分、300P组分、400P组分和500P组分含量增加，表明有机改良剂可增加水稻土腐殖化程度较高的胡敏酸组分的含量。而淹水水稻土中可交换性养分离子的有效性以及N矿化动力学特征，则取决于有机碳底物的腐殖化程度。施用有机改良剂对水稻土中胡敏酸的300P组分含量影响更为显著 (P≤0.05)，施用堆肥使胡敏酸的300P组分在总胡敏酸中占的比例从对照土壤的34%提高到47%。裂解气质联机色谱仪分析结果表明，300P组分的甲基酮和桂醛等化合物，分别来自碳水化合物和木质素，贡献率都在40%以上，可见，含碳的生物多聚物、简单的碳水化合物、复杂的木质素等，这些物质对于腐殖物质合成具有同等重要的作用，施入水稻土后，均能够提高土壤稳定碳库。

致谢和参考文献(略)