Espin WH结构域抑制whirlin全长与espin M结构域在体外细胞相互作用

韦 博，宫贤惠，尹艳春，隋 源，郝继龙，刘婉瑶，王 乐＊

（1.吉林大学中日联谊医院神经外科，吉林长春130033；2.温州医科大学附属眼视光医院白内障科，浙江温州325000；3.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012；4.吉林大学第一医院眼科，吉林长春130021）

Espin WH结构域抑制whirlin全长与espin M结构域在体外细胞相互作用

韦 博1▲，宫贤惠2▲，尹艳春3，隋 源3，郝继龙4，刘婉瑶3，王 乐4＊

（1.吉林大学中日联谊医院神经外科，吉林长春130033；2.温州医科大学附属眼视光医院白内障科，浙江温州325000；3.吉林大学生命科学学院，吉林长春130012；4.吉林大学第一医院眼科，吉林长春130021）

目的 具体研究Espin的结构域与whirlin全长在体外细胞的相互作用。方法 通过免疫共沉淀方法进一步研究Espin的多个结构域与whirlin全长在体外细胞的相互作用。结果 在HEK293细胞中，Espin－A结构域、espin－P结构域与whirlin全长相互作用，espin M、espin WH结构域没有和whirlin全长存在相互作用。结论 Espin WH结构域抑制whirlin全长与espin M结构域在体外细胞相互作用。

Usher综合征II型；espin

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0886）

Usher综合征（USH）是一种常染色体隐性遗传病，在全世界范围内发生率为1／23000［1－3］。占失明和耳聋疾病的50%，先天性耳聋的5%和视网膜色素变性的18%。在欧洲，USH1，USH2和USH3通常占所有USH患者比例分别为25%－44%，56%－75%，2%［1］，以耳聋和眼盲这两方面为特征。在临床上根据听力和前庭症状的严重程度，USH可分为三种类型［4，5］，I型（USH1）患者严重的先天性耳聋以及严重前庭功能障碍；USH2患者表现为先天性中等度的听力受损和正常前庭功能；USH3患者表现为循序渐进的听力损害和偶尔的前庭功能障碍。以上三种类型的视力障碍主要表现为视网膜色素变性［1，6－8］，早期表现为夜盲，外周视力下降和最终中心视力下降。USH是导致失明和耳聋为特征的最普遍的基因疾病。Usher综合征II型的特点是从出生开始循序渐进的听力损失，视力丧失通常在青春期或成人期。听力损失也从轻微到严重，主要影响高音调。

以往研究Usher综合征II型证明espin＿A结构域、espin＿P结构域、espin＿M结构域和whirlin全长共定位，下面我们具体研究下在HEK293细胞中，Espin A结构域、espin P结构域、espin M结构域、espin WH结构域与whirlin全长相互作用，进一步探索USH综合征的发病机制。

1 资料与方法

1.1 仪器

细胞培养箱、恒温水箱、低温离心机、超声振荡器、PVDF膜、倒置显微镜、荧光显微镜、共聚焦显微镜。

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 细胞培养和瞬时转染

DMEM培养液中加入8%胎牛血清，于37℃恒温箱培养HEK293细胞，待细胞覆盖率达到90%后，用LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）将目的质粒瞬间转染入HEK293细胞，即：将0.5μg的两种目的质粒加入30μl的DMEM培养液中，再加入LipofectamineTM2000 2μl，室温放置10min，均匀加入细胞培养液中，37℃恒温箱孵育10h，观察荧光蛋白表达。

1.2.2 体外细胞免疫共沉淀和western blotting

收集荧光蛋白表达成功的HEK293细胞，加入裂解液并进行裂解。离心后于上清液中加入蛋白G继续缓慢摇晃1h。离心弃沉淀、上清液中加入whirlin抗体摇晃孵育3.5h，离心20 000g 8min。得到的上清液中加入蛋白G sepharose，缓慢摇晃1 h。慢速离心2 000g 10s后，用裂解液洗沉淀物三次，收集洗涤液用Laemmli buffer煮沸10min。所有的操作过程均在0℃条件下进行。

取适量细胞裂解液和洗涤液用SDS－PAGE胶分离提纯并转移到PVDF膜。含有10%脱脂牛奶里孵育1h，来源于兔GFP抗体4℃孵育4h，二抗室温孵育1h，显色剂显色观察最终蛋白条带。

2 结果

2.1 Espin的四个结构域

Espin的四个结构域如图1所示。橙色代表EspinA，有八个并列相连重复氨基酸序列组成；深蓝色代表espinP，主要含有脯氨酸；绿色代表espin－WH，主要是和威斯科特奥尔德里奇综合征同源蛋白结构域，红色代表espinM，主要是促进actin肌束形成。

图1 espin结构域示意图

2.2 Espin WH结构域抑制whirlin全长与espin M结构域在体外细胞相互作用

从以往实验结果来看，espin＿A片段、espin＿P片段、espin＿M片段和whirlin全长共定位，而espinWH片段则没有和whirlin全长共定位。从免疫共沉淀的western结果来看，在whirlin的沉淀物中有espin A和espin P条带，而没有espin M和espinWH条带，说明espin A和espin P和whirlin存在相互作用，而espin M和espinWH和whirlin没有相互作用。值得注意的是：在espin M和whirlin双转染的细胞里，也可见espin M和whirlin共定位。这个结果提示我们espin M可能受上游调控和whirlin相互作用。由于espin WH片段不与whirlin共定位也不存在相互作用，所以espin WH可能是抑制espin M和whirlin的相互作用。

3 讨论

EspinA可以结合myosinIIIa，并进行物质交换，从内耳毛细胞静纤毛的基底部转运espin到静纤毛的尖端。因此，whirlin和espinA在静纤毛基底部之间的相互作用可以调控espin转运。Espin P除了结合whirlin外，espin P还结合IRSp53和profilin［9］，共同参与espin与whirlin的相互作用。值得一提的是，Eps8既与whirlin相互作用［10］，又与IRSp53相结合［11］。最终在小鼠体内whirlin，espinP，Eps8和IRSp53形成一个蛋白复合体，在espin基因敲除的小鼠内，内耳毛细胞的myosin Xva蛋白位置会发生变化［12］。

视网膜感光细胞分为外节、内节和连接纤毛三部分，感光细胞外节主要负责光信号传导，视网膜感光细胞外节和内节之间通过一个狭长的连接纤毛相连。连接纤毛的旁边有一对中心体，EspinWH结构域就是调控神经元的中心体产生形成肌动蛋白束［13］。从实验结果来看，espinWH是抑制whirlin和espinM之间作用，阻止espinM结合肌动蛋白单体形成肌动蛋白束。

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Espin WH domain inhibit the association between espin ABM domain and whirlin

WEI Bo，GONG Xian－hui，YIN Yanchun，et al.（China－Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun130033，China）

Objective Studing the association between Multiple regions of espin and whirlin in vitro.Methods Transfecting espin＿A domain，espin＿P domain，espin＿WH，espin＿M domain and whirlin－F in HEK293cell，use whirlin antibody immunoprecipitate target protein.Results Identifying espin＿A domain，espin＿P domain interact with whirlin－F.But espin＿WH domain and espin＿M domain did not.Conclusion Espin WH domain inhibit the association between espin ABM domain and whirlin.

USH2；whirlin；espin

R774

A

2014－07－09）

1007－4287（2015）06－0886－03

国家自然青年科学基金项目（81400404）；吉林省科技发展计划资助项目（20140520034JH）；吉林大学白求恩青年科研基金项目（2013205030）

＊通讯作者，▲共同第一作者