外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达和胞外分泌策略研究综述

陈阿娜 叶生梅 孟娜 刘艳

摘 要：采用大肠杆菌作为表达宿主进行蛋白质异源表达的研究逐渐增多，然而实验过程中存在2个突出问题：（1）可溶性表达量低;（2）胞外分泌能效差。该文系统地综述了当前的国内外研究现状，内容涉及外源蛋白在大肠杆菌中高效可溶性表达策略及胞外分泌策略，并对实验中存在的问题和和研究趋势提出了见解。部分策略已用于实验教学并取得了良好的教学效果。

关键词：大肠杆菌;可溶性表达;胞外分泌;研究趋势

中图分类号 R394.8文献标识码 A  文章编号 1007-7731（2015）13-25-03

Advances of Soluble and Extracellular Overexpression of Heterologous Proteins in Escherichia coli

Chen Ana et al.

（School of Biochemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：Heterologous proteins expression in E.coli has been gradually increased in recent years. However，there are two outstanding issues during the experiment（1）low soluble expression level;（2）poor secretion efficiency. This paper systematically reviews the currentresearch status，which relates strategies of soluble expression，extracellular secretion，experimental problems in E.coli，and puts forward opinions of research trends. Some of the strategies have been used in experimental teaching and achieved good teaching results.

Key words：E.coli;Soluble expression;Extracellular secretion;Research trends

采用野生型菌种发酵生产目标蛋白的效率较低，通过基因工程技术进行异源高效表达是降低生产成本的有效途径。常用的宿主菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，也有在毕赤酵母中表达的报道。与其他宿主菌相比，大肠杆菌具有3个显著优势：细胞生长快速、分子操作简单和能在廉价培养基中高密度培养，使其成为科研、生产中最常用的原核表达宿主[1]。但是我们并不回避外源基因在大肠杆菌中表达时存在的2个突出问题：（1）可溶性表达量低;（2）胞外分泌能效差[2]。近年来研究者尝试了多种策略提高可溶性表达量和分泌效率，研究主要集中在调控发酵过程参数，优化培养基等措施上，对外源蛋白自身改造的研究相对较少。

1 研究现状

外源蛋白在大肠杆菌中的表达调节是一个包括诸多元素的复杂系统，并非每一种蛋白都能在大肠杆菌中高效表达，部分蛋白无法表达[3]。由于大肠杆菌分泌系统的组成元件复杂、调控精细以及固有的双层膜结构，因此大肠杆菌表达系统的分泌性能较差[4]。笔者对当前外源蛋白在大肠杆菌中过量可溶性表达策略和高效分泌策略概括如下。内容涉及质粒改造、宿主菌改造、底物蛋白改造、发酵过程参数调控及培养基优化等方面。

1.1 质粒和宿主的有效改造和组合 通过对质粒元件的合理构建，可在转录水平和翻译水平上调节蛋白合成。如在指导学生采用大肠杆菌表达人源化治疗性抗体片段时，对pAVEwayTM质粒进行操纵子双回文结构改造和启动子替换，使得外源蛋白的表达量显著提升（数据还未发表）;Olins等从T7噬菌体基因前导序列中鉴定了—9bp的序列g10-L，该序列能使多种基因的表达水平提高40～340倍。若将其置于合成SD序列的上游，按照β-半乳糖苷酶的活性与LacZ mRNA的水平来估计，g10-L序列能使LacZ的翻译水平提高110倍[5]。大肠杆菌II型分泌系统中蛋白跨外膜分泌主要依靠非特异性渗漏，效率较低，可通过构建外膜渗漏型突变株以提高蛋白胞外分泌水平。如Gumpert等构建了缺少细胞壁和周质空间的L-型菌株用于青霉素G酰基转移酶、葡萄球菌激酶和微小抗体的制备[6]。Ni等构建了敲除外膜脂蛋白的突变株，使麦芽糖结合蛋白、木聚糖酶和纤维素酶的胞外分泌比例达到总表达量的90%以上[7]。早期的研究多集中在此领域，并且已有和将有许多优良的商业化质粒和宿主可供选用。当前的研究普遍采用“试错法”，即直接采用商业化的质粒和大肠杆菌变种，构建合适的表达系统。

1.2 优化信号肽 江南大学吴敬团队研究发现不同的翻译起始区氨基酸序列和pelB信号肽切割位点的数量会影响外源蛋白翻译和折叠效率，继而影响跨膜分泌过程，通过增加信号肽切割位点数量和随机突变翻译起始区氨基酸序列，获得基质分泌能力显著提升的突变体[8]。亦有研究表明适当增加II型分泌系统信号肽N端带电区域的正电荷或疏水区域的疏水性有利于提高前体蛋白的分泌效率[9]，但目前并无如何根据指定的目标蛋白选择合适的信号肽进行分泌表达的通用规则。

1.3 融合表达和共表达分子伴侣 多种融合蛋白，如谷胱甘肽S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）等均已被证实能成功地表达折叠正确、有生物活性的蛋白，能明显提高在大肠杆菌细胞质中的可溶性，减少包涵体的形成。分子伴侣是细胞中一大类蛋白质，在细胞内帮助其他蛋白完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白结构执行功能时的组份。采用分子伴侣在大肠杆菌中进行外源蛋白高效表达成为近年来的研究热点，如通过共表达镰状疟疾虫分子伴侣增强了抗疟疾药物靶标环化水解酶的表达量[10]。

1.4 共表达或改造转运蛋白 在大肠杆菌Ⅱ型分泌系统中，外源蛋白通过Sec或Tat途径进入周质空间，再通过约12～16种蛋白质组成的外膜通道分泌至胞外。然而，由于转运蛋白的天然表达量低，转运效率有限，使得外源蛋白在大肠杆菌中分泌效能低。可通过共表达或改造参与跨膜转运的关键性转运蛋白或辅助蛋白以改善转运通路进而提高蛋白分泌水平[11]。如Miksch等将大肠杆菌素释放基因与β-葡聚糖酶共表达时，大肠杆菌的外膜通透性明显增加，使得大量原本定位在周质空间中的β-葡聚糖酶释放至胞外培养基中[12]。Sugamata等针对I型分泌系统转运蛋白HlyB和HlyD进行定向改造，获得了使枯草芽孢杆菌蛋白酶E胞外分泌量提高27倍的突变体[13]。

1.5 外源蛋白自身的改造 一种简单的方式是优化蛋白编码基因密码子。在实际应用中，可通过全基因合成优化密码子、稳定mRNA结构[14]。另一种方式是通过蛋白质工程改造既定蛋白。近年来采用蛋白质工程改造目标蛋白，提高其在大肠杆菌中的分泌效率方面取得了一定进展。如杰能科公司2011年将脱支芽孢杆菌普鲁兰酶N端处104个氨基酸截短后，发现截短体比全长蛋白具有更高的胞外分泌能力。专利发明人推测这种现象可能与重组酶分子量的减小有关[15]。最新的研究报道通过在蛋白质N端添加连续的5个天冬氨酸，使得南极假丝酵母脂肪酶B在大肠杆菌中的胞外分泌量达到1.9g/L。添加的5个天冬氨酸使脂肪酶B二聚体的四级结构发生翻转，新的二聚体结构可能形成某种结构信号肽与GSP（General secretion pathway）上的特定通道蛋白相互识别，促使目标蛋白分泌至胞外[1]。

1.6 发酵过程参数控制和培养基优化 该方式是一种简单的提高外源蛋白表达量和分泌量的常用策略，因过程和原理相对简单，使用较为普遍。如陈文波等通过分阶段调控发酵过程温度，使得目标蛋白在大肠杆菌中的表达量和分泌量均有大幅提升[16]。通过添加表面活性剂、渗透剂、金属离子和甘氨酸等培养基添加剂能够提高细胞膜的通透性，有助于加强蛋白分泌。如聂尧等通过在发酵后期再培养基中添加0.6%的甘氨酸，可使90%以上的目标蛋白分泌至胞外[17]。此外还可通过优化培养基的营养成分，调控细胞培养的温度、pH和溶氧等环境参数，获得有利于细胞生长和蛋白胞外分泌的发酵策略。

2 存在的问题和研究趋势

综上所述，在提高大肠杆菌外源蛋白表达及分泌水平研究中，以往焦点主要集中在表达系统和工艺水平上，但是几乎所有成功案例都具有蛋白特异性。尽管目前在强化大肠杆菌分泌重组蛋白的效能方面取得了一定的进展，但其普遍适用性和有效性并不乐观，重组蛋白在大肠杆菌中的高效胞外分泌型表达仍然是一个技术难点。通过数据库对比研究发现，采用完全相同的表达系统和发酵工艺表达不同的外源蛋白时，表达量和分泌效率往往有数量级上的差距。据此推测外源蛋白本身一级氨基酸序列至三级空间结构甚至四级结构也是影响表达水平的重要因素，通过蛋白质工程改造既定蛋白可能是实现高效表达和分泌有效途径。

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（责编：张长青）