基于TRIZ原理的灭活疫苗中抗原空间表位的创新应用

张琳等

摘 要：TRIZ是技术和产品创新一种重要方法，已在农机装备、农业金融、农产品加工等农业领域成功的进行了应用，但兽医领域尚未尝试。本研究基于TRIZ原理，应用系统分析、三轴分析和矛盾分析对灭活疫苗生产过程中病原蛋白质的破坏问题进行了剖析，创新性提出了利用抗原空间表位建立灭活疫苗安全性检验的新方法，反向指示疫苗是否安全的新思路。研究结果证实，TRIZ理论完全可以在兽医领域中应用，能够为技术难题提供新思路和方案。

关键词：TRIZ原理；灭活疫苗；抗原空间表位

引言

灭活疫苗是我国目前制备工艺成熟、使用广泛、安全有效的疫苗，它以病原为基本物质，与灭活剂充分作用后加入佐剂制成，一方面因病原抗原表位的存在可以刺激机体产生抗体达到清除病原的目的，另一方面因病原的核酸与蛋白完全失活保证了使用与环境的安全，所以被广泛应用于多种疾病的预防。在病原确定的情况下，灭活疫苗制备的关键步骤是灭活，只有完全灭活的安全疫苗才能进行应用。但灭活的过程中破坏了病原蛋白的活性，致使疫苗产生的效力有所损失，同时蛋白活性作用无从体现。所以，在灭活疫苗生产中如何避免蛋白构象的破坏和实现蛋白的创新利用，本研究尝试利用TRIZ进行探索。

TRIZ理论全称为“发明问题解决理论”，是一种指导创新的方法论[1]。TRIZ理论产生于工程技术领域，主要解决泛制造业的技术难题。但随着理论的发展和逐步完善，逐步向企业管理、政治、教育、服务的非技术领域延伸。近年来，在科技部等四部委的倡导下，TRIZ理论在农业领域也迅速铺开，已在农机、农业金融、农产品加工等领域进行了尝试，为诸多技术难题的攻关提供了方案或者思路。对于TRIZ理论能否在兽医领域应用，文章将首先在灭活疫苗抗原空间表位的应用上进行尝试，探索全新高效的利用方案。

1 TRIZ理论简介

TRIZ理论是前苏联科学家阿奇舒勒[2]在研究了大量的专利后发现不同的发明在使用了相同的原理和解决方法，并且产品和技术系统是按照一定规律去发展的，在此基础上他创立了TRIZ理论。TRIZ理论有几个最重要的组成部分[3]——技术系统、资源、矛盾，这也是解决问题流程中的基础部分。技术系统是TRIZ提出问题时所选择的对象，系统可大可小，任何系统又包括一个或多个子系统，在系统之外则是超系统；系统确定分析后需要进行资源分析，系统资源可分为自然、时间、空间、系统、物质、能量场、信息和功能八类；矛盾是一个系统存在的难以解决问题的根源，可分为技术矛盾和物理矛盾。

在问题定义和转化为TRIZ工程问题后，TRIZ提供了三种重要方法和工具[4]：一是创新原理，用于消除技术矛盾，共40条，并形成矩阵。当问题确认为技术矛盾后，可根据矛盾选择工程参数，然后找到创新原理来消除矛盾。二是分离原理，当矛盾为物理矛盾时，采用分离原理来解决，主要有从时间、空间上分离，部分与整体分离等方法。三是物场模型，一个功能必须同时具有三个基本元件才能存在，三者分别为两种物质和物质间相互作用的场。物场模型可以用来发现系统中的结构化问题，解法为76种标准解。（见图1）

2 问题提出与TRIZ模型分析

2.1 问题的定义和分析

TRIZ对于问题的解决是从系统的确定开始的。上文提到系统的选择可大可小，但范围的选择至关重要，如系统选择过小，则系统内子系统过少或者没有，相互之间的关系和功能缺乏，造成解决方法过少；如系统选择过大，则系统内子系统过多而超系统少，内部关系复杂难以完整分析。在本研究中选择灭活疫苗为技术系统，组建组件模型和确定功能关系，如下图所示。

其中灭活剂为超系统组件，疫苗为作用对象。在该组件系统中，定义存在问题的功能关系有两个，即“灭活剂-破坏-有害”和“佐剂-包裹-不足”。佐剂的内容较为复杂，做另文发表，这里针对“灭活剂-破坏-有害”这一问题进行解决方案的探索。

问题定义和系统分析后进行三轴分析。三轴分析是从因果轴、操作轴和资源轴出发，分析当前技术问题的根本原因和解题资源，达到以最低成本解决问题的目的。针对灭活剂的破坏作用，首先进行因果分析。目前疫苗生产中广泛应用的灭活剂是甲醛，在灭活过程中，主要是灭活病原的蛋白质及包裹在内的核酸。灭活进行时，甲醛首先作用于核酸，与腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的碱基结合而使病毒核酸变性。当甲醛继续作用，就与蛋白质的胺基结合，形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，而后再与酰胺发生交联反应，致使蛋白质变性，并阻止核酸的逸出。所以，甲醛灭活蛋白发生在核酸灭活之后，蛋白质变性才能保证疫苗的完全灭活。蛋白质由氨基酸組成，能够激活免疫系统的氨基酸称为抗原表位（抗原决定簇），表位依据形态又可分为线性表位和构象（空间）表位。空间表位因其存在的位置和构象，往往能比线性表位更好地被免疫系统识别，产生特异性抗体。但灭活剂发生作用时，空间表位随之被破坏，形成线性表位的状态或者失去蛋白活性，而线性表位因本身长度较短的线性状态则基本不受影响，所以灭活剂的有害作用根本原因是破坏了空间表位的构象。由此可见，灭活疫苗的灭活对象关键组分是蛋白的空间表位。

在因果分析中找到了问题的根本所在，在资源轴上考虑能否不使用灭活剂或者换成其他的灭活剂（如BPL、BEI）解决因空间表位被破坏而损失疫苗免疫效价的问题。但因安全、成本和适用范围的原因不是最合适的方案。

在目前的生产中，灭活虽然破坏了蛋白空间表位，损失了疫苗产生的效价，但以安全为前提的情况下，空间表位的作用被忽略了。根据三轴分析的结果，针对灭活剂对空间表位的破坏作用，如何在保证安全的前提下降低空间表位的破坏和高效利用，设计出一个初步方案：调整甲醛的工作时间和浓度，减少对于空间表位构象的破坏程度。

运用TRIZ理论进行发明、创新的关键是找出矛盾，并分析技术矛盾或物理矛盾，然后运用TRIZ的解题工具找出解决矛盾的思考方向。对于初步方案的分析，得到一对技术矛盾，虽然减少了灭活剂对空间构象的破坏，但疫苗的安全性无法得到保障。对照TRIZ矛盾矩阵，这对矛盾改善了“作用与物体的有害因素”却恶化了“可靠性”。查找矛盾对应的创新原理有四个，分别为廉价替代品原理、借助中介物原理、抽取原理和复合材料原理。其中抽取原理为问题的解决提供了新的思路。抽取原理的内容有两条：一是从物体中抽出产生负影响的部分或属性，二是从物体中抽出必要的部分或属性。对应到灭活剂破坏病原蛋白空间表位的问题上，既然灭活疫苗以安全为首要目标，必须进行病原的完全灭活，解决方案应转变思路，将蛋白空间表位抽提出来，作为灭活疫苗是否安全的指示系统，建立灭活疫苗灭活是否完全的检测新方法，实现空间表位的高效利用。

2.2 解决方案的设计

2.2.1 总体方案

利用TRIZ分析获得的方案，以灭活疫苗灭活中间产品蛋白空间表位的破坏为标准，建立灭活疫苗灭活程度的检验方法，即安全性检验新方法。新方法集成了疫苗灭活、蛋白结构、免疫学检测的相关技术，不仅解决了空间表位的创新利用，而且与现行灭活疫苗安全性检验方法相比，有三个突出特点：一是提高了检测精度，变定性检测为定量检测；二是缩短了检测时间，整个检测过程最多只需24小时；三是提高了检测的准确性，利用免疫学技术纠正肉眼不易观察的病变。

2.2.2 方案基础

（1）灭活。如因果分析所述，目前疫苗生产中广泛应用的灭活剂是甲醛，甲醛灭活蛋白发生在核酸灭活之后，蛋白质的变性能够作为灭活完全的标志。（2）抗原表位。同样如因果分析所述，空间表位存在与否与蛋白是否变性是一致的，能够作为灭活完全的判定标准。（3）空间表位的确定。肽扫描技术、氨基酸突变、X-ray、质谱、噬菌体展示等均可用于空间表位的筛选[5]。利用这些方法，能够简单可靠的确定大多数病毒主要抗原蛋白的空间表位，用于相关研究，保证了利用空间表位检验灭活疫苗安全性成为可能。（4）ELISA检测技术。免疫学检测常用技术，以抗原抗体反应为基础。利用基因工程技术对空间表位或其所在蛋白进行可溶性表达，以保证制备的蛋白具有天然构象。随后使用蛋白进行动物免疫，制备相应的单克隆或者多克隆抗体，从而建立双夹心ELISA检测方法。通过灭活原理和抗原表位的分析，明确了空间表位在灭活过程中的作用，然后結合ELISA技术完成安全性的检测。

2.2.3 应用示例

以Lasota株灭活疫苗灭活程度的检测为例。在生产中以鸡胚接种尿囊腔的方式进行病毒的增殖，随后收集尿囊液以甲醛为灭活剂进行灭活。利用肽扫描技术发现，HN蛋白163-569位氨基酸包含的7个抗原表位均为空间表位。以HN 163-569位氨基酸为目的蛋白，应用昆虫细胞-杆状病毒表达系统为表达媒介进行蛋白的表达，获得具有天然构象的蛋白。将蛋白纯化后免疫小鼠三次，采血分离血清制备多克隆抗体。制备抗体后建立检测新城疫病毒的双夹心ELISA方法。应用的特异性NDV HN抗体和酶标的NDV HN抗体为制备的多克隆抗体。最后通过分光光度计测定OD450的值，结合阴阳性对照，最终确定待检样品的灭活程度。如检测结果为阳性，则表明灭活中间品未灭活完全，结果为阴性时，则灭活中间品灭活完全。整个检测过程可在24小时内完成。

疫苗灭活过程中对空间表位的破坏是不可避免的，使原本可以有效激发机体免疫的主要组分不能发挥作用，在这种情况下如何合理运用、充分发挥空间表位的作用，TRIZ提供了新的思路：一是利用抽提原理将空间表位分离出来加以利用，在破坏不可避免的情况下变害为利，结合分子生物学、免疫学等技术建立新的检验疫苗安全性的方法，用以指示疫苗是否灭活完全；二是解决了目前疫苗安全性检测方法的缺点。现行灭活程度的检验一般通过接种对本毒敏感的细胞、禽胚或实验动物，根据病变或死亡状况进行判定，需花费多达5-6天的时间，耗时长且中间操作过程要求严格。传统的方法在要求生产效率提升和科技创新的背景下已不合时宜。TRIZ原理提供的新方法解决了以上不足。

3 结束语

灭活疫苗的问题虽小，但说明TRIZ理论完全可以在兽医领域进行应用，为科研和技术难题的攻关提供新思路和方案。这是TRIZ理论在兽医领域应用的一次有益尝试，也为在农业领域的全面应用提供了借鉴。

参考文献

[1]丁俊武，韩玉启，郑称德.创新问题解决理论-TRIZ研究综述[J].科学学与科学技术管理，2004，11：53-60.

[2]Nakagawa T. Education and training of creative problem solving thinking with TRIZ/USIT[J]. Procedia Engineering， 2011，9：582-592.

[3]井辉，郇志坚.基于TRIZ的复杂管理问题求解模式研究[J]. 科学学与科学技术管理，2005，11：155-159.

[4]郭 ，张峭，赵思健，等.基于TRIZ原理的农村中小企业贷款难解决方案研究[J].中国科技论坛，2014，4：123-128.

[5]文雪霞，陈化兰，熊永忠，等.抗原表位鉴定方法的研究进展[J].中国畜牧兽医，2012，39（7）：66-70.

作者简介：张琳（1984-），男，山东济南人，山东省农业科学院畜牧兽医研究所助理研究员。