刘慧萍等
摘要:目的 探讨补肾活血方抑制卵巢早衰(POF)小鼠卵泡颗粒细胞凋亡的作用机制。方法 以小鼠透明带3为抗原,皮下多点注射免疫BALB/c雌性小鼠建立免疫性POF模型。取40只清洁级雌性小鼠,随机分为空白组、模型组、阳性药组、补肾活血方组。补肾活血方组给予补肾活血方药液灌胃,阳性药组给予戊酸雌二醇药液灌胃,模型组和空白组给予等量生理盐水灌胃,2次/d,连续15 d。取卵巢、子宫、胸腺进行称重,计算其脏器指数;HE染色观察颗粒细胞凋亡情况;采用放射免疫法检测雌二醇(E2)、促黄体生成激素(LH)和促卵泡生成激素(FSH)的水平;采用RT-PCR分析卵巢颗粒细胞中Fas、Fas-L mRNA表達情况。结果 与空白组比较,模型组卵巢、胸腺、子宫质量和E2水平显著降低(P<0.05,P<0.01),FSH、LH水平和Fas、Fas-L mRNA表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,给药组颗粒细胞凋亡明显减少,卵巢指数、子宫指数、胸腺指数增加(P<0.05),E2水平升高(P<0.01),FSH、LH水平及Fas、Fas-L mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论 补肾活血方可调节下丘脑-垂体-卵巢轴的激素水平,通过降低Fas、Fas-L的mRNA表达抑制细胞凋亡。
关键词:补肾活血方;卵巢早衰;颗粒细胞;细胞凋亡;小鼠
DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2015.014
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2015)04-0047-04
Effects of Bushen Huoxue Prescription on Granulosa Cell Apoptosisi of Premature Ovarian Failure Mice LIU Hui-ping, XIAO Yi, LI Ling, QI Peng, SONG Yan, LI Jia-jun, YI Hai-qing, KE Chao, ZHANG Guo-min (Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)
Abstract:Objective To discuss Bushen Huoxue Prescription mechanism of action on follicular granulosa cell apoptosis of premature ovarian failure (POF) mice. Methods The mouse zona pellucida 3 as the antigen, multi-point injection of subcutaneous immunization BALB/c to female mice was used to establish autoimmune POF model. Forty clean female mice were randomly divided into blank group, model group, Estradiol Valerate group and Bushen Huoxue Prescription group. All medicine groups were given relevant medicine for gavage, while model and blank groups were given normal saline with the same amount for gavage for 15 days. After the treatment, ovary, uterus, and thymus were weighed, and the viscera index was calculated. An ovarian slice was taken and HE staining was used to observe granulosa cell apoptosis. The levels of E2, LH, and FSH were detected by using the radioimmunoassay method. RT-PCR was used to analyze Fas and Fas-L mRNA expressions in ovarian granulosa cells. Results Compared with blank group, the weight of ovary, thymus, and uterus decreased significantly (P<0.05, P<0.01);Serum E2 level dropped (P<0.01);levels of FSH and LH, and expressions of Fas and Fas-L mRNA increased significantly (P<0.01). Compared with model group, granulosa cell apoptosis significantly decreased, and ovary index, uterus index, and thymus index increased (P<0.05);serum E2 level
基金项目:国家自然科学基金(81303123);中国博士后科学基金(2013T60770、2012M511382);高等学校博士学科点专项科研基金(20114323120007);湖南省重点实验室开放基金(2014XNFZ06);湖南省大学生创新训练中心资助项目(2013年);湖南省重点学科-中西医结合基础(2012年);湖南中医药大学重点学科-病理学及病理生理学(2012年)
通讯作者:张国民,E-mail:834095773@qq.com
increased (P<0.01);levels of FSH and LH, and expressions of Fas and Fas-L mRNA significantly decreased (P<0.05). Conclusion Bushen Huoxue Prescription can decrease expressions of Fas and Fas-L mRNA to inhibit cell apoptosis by adjusting the hormone level of hypothalamus-pituitary- ovarianaxis.
Key words:Bushen Huoxue Prescription;premature ovarian failure;granulose cell;cell apoptosis;mice
卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指婦女40岁以前出现闭经、雌激素缺乏、促性腺激素水平升高为特征的一种疾病。国外研究显示,本病在40岁以前的妇女中发病率为1%~2%,30岁以前的妇女发病率为0.1%,20岁以前的发病率为0.01%[1-2]。该病可导致不孕、更年期症状提前、骨质疏松等并发症,伴随卵泡颗粒细胞出现核固缩、胞浆出现空泡、形成闭锁小体等凋亡形态的改变。卵泡颗粒细胞在卵母细胞体内外成熟过程中起着重要的作用。研究表明,由生殖激素控制的颗粒细胞凋亡是直接控制卵泡排卵或闭锁的重要因素[3]。本实验观察了补肾活血方对POF小鼠颗粒细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制,为研究卵巢细胞凋亡及人为控制卵泡的发育等提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
40只清洁级健康雌性BALB/c小鼠,体质量18~22 g,7~8周龄,湖南中医药大学动物实验中心提供,合格证号SCXK(湘)2011-0003。饲养于湖南中医药大学清洁级实验动物中心,自由饮水和摄食。
1.2 药物
补肾活血方由紫石英、补骨脂、菟丝子、熟地黄、生地黄、桑寄生、覆盆子、山萸肉、土鳖虫、水蛭、鸡内金、路路通、泽泻、泽兰、桔梗、乌药、甘草组成。武火煮沸,文火煮40 min,过滤,重复煎2次,合并滤液,浓缩至2倍临床等效剂量1.08 g/mL的无菌药液。饮片购于湖南中医药大学第一附属医院。戊酸雌二醇片,德国拜耳医药有限公司,批号J20130009,用温开水溶解药片,制成溶液,调整浓度为0.006 mg/mL。购于湖南中医药大学第一附属医院药房。
1.3 主要试剂与仪器
小鼠透明带多肽溶液,小鼠透明带3(ZP3)的第330-342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR),分析纯度>90%,杭州中肽生化有限公司,批号P00105;弗氏完全佐剂,美国Sigma公司,批号F5881;弗氏不完全佐剂,美国Sigma公司,批号F5506;雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)、促卵泡生成素(FSH)放免试剂盒,批号08112O,购自北京科瑞美科技有限公司;总RNA提取试剂盒,批号092134,购自北京佰亿新创科技有限公司;总RNA提取试剂盒,购自杭州博日科技有限公司。MP-120-2型电子天平(上海第二天平仪器厂);LEICA DM LB2型双目显微镜、LEICA RM2255全自动轮转切片机(德国LEICA公司生产)。
1.4 造模与分组
取6 mg ZP3透明多肽粉末,加入6 mL双蒸水配成溶液,与弗氏完全佐剂按1∶1配制成免疫试剂,与弗氏不完全佐剂按1∶1配制成免疫强化试剂。每日上午9点,参考文献[4]方法,每只小鼠给予0.15 mL免疫试剂注射双后脚掌处及腹腔皮下,14 d后以免疫强化试剂0.15 mL再次注射双后脚掌处及腹腔皮下加强免疫,建立免疫性POF模型。空白组每次造模时每只小鼠予0.15 mL生理盐水注射双后脚掌处及腹腔皮下。取40只清洁级雌性小鼠,随机分为空白组、模型组、阳性药组、补肾活血方组,每组10只。补肾活血方组以2倍临床等效剂量(1.08 mL/20 g)补肾活血方药液灌胃,阳性药组给予0.4 mL/20 g戊酸雌二醇药液灌胃,模型组和空白组给予等量生理盐水灌胃,均2次/d,连续15 d。
1.5 指标检测
1.5.1 脏器指数检测 眼球取血后,脱颈处死动物,摘取卵巢、子宫、胸腺组织称重,计算脏器指数(脏器指数=脏器质量/体质量)。
1.5.2 病理形态学观察 取卵巢称重后,加入4%多聚甲醛溶液中固定,梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片,脱蜡,常规HE染色,做病理切片。观察卵巢内正常卵泡和闭锁卵泡的形态变化。
1.5.3 雌二醇、促黄体生成激素和促卵泡生成激素检测 眼球取血,并迅速离心分离出血清,采用放射免疫法检测血清中E2、FSH、LH的含量。
1.5.4 Fas、Fas-L基因表达检测 取卵巢组织匀浆,用RNA试剂盒提取mRNA,采用RT-PCR检测颗粒细胞中Fas、Fas-L mRNA表达。
1.6 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示,成组设计资料采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 补肾活血方对小鼠脏器指数的影响
与空白组比较,模型组卵巢、胸腺、子宫指数显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,阳性药组、补肾活血方组卵巢、胸腺、子宫指数升高(P<0.05);与阳性药组比较,补肾活血方组小鼠卵巢、胸腺指数升高(P<0.05),子宫指数无明显变化。见表1。
2.2 补肾活血方对小鼠雌二醇、促黄体生成素和促卵泡生成素水平的影响
与空白组比较,模型组E2水平降低,FSH、LH水平升高(P<0.01);与模型组比较,补肾活血方组、阳性药组E2水平升高,FSH、LH水平均降低(P<0.01);与阳性药组比较,补肾活血方组E2水平升高,FSH、LH水平降低(P<0.05)。见表2。
2.3 补肾活血方对小鼠卵巢形态学及颗粒细胞凋亡的影响
镜下观察模型组卵巢体积缩小,卵巢皮质内见少量初级卵泡及生长卵泡,黄体数量少,闭锁卵泡多,可见较多间质、纤维血管、间质腺,颗粒细胞凋亡明显,数量明显减少;补肾活血方组卵巢皮质内见大量初级卵泡及生长卵泡,较多近成熟卵泡,黄体数多,黄体生长良好,颗粒细胞凋亡明显少于模型组。见图1。
2.4 补肾活血方对小鼠卵巢中Fas、Fas-L mRNA表达的影响
Fas、Fas-L mRNA灰度分析结果见图2。与空白组比较,模型组Fas、Fas-L mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,补肾活血方组Fas、Fas-L mRNA表达水平降低(P<0.05)。
3 讨论
卵巢早衰在中医学中无专门记载,可归属于“血枯”“血隔”“闭经”等范畴。其病因病机主要为肾虚胞阻,治疗原则主要是补肾通络。补肾活血方由湖南中医药大学尤昭玲教授经长期临床实践组方,主治肾虚胞阻型卵巢早衰[5-6]。该方配伍严谨,用药精当,既符合中医组方特色,又依据现代医学方法,切中病机,以达补肾通络之功效。本病是肾阴、肾阳同时虚损所致,故方中重用紫石英温补肾阳,熟地黄平补肾阴,两药共为君药;补骨脂、菟丝子、生地黄、桑寄生、山萸肉、覆盆子合用为臣药,使肾阴得养、肾阳得化;泽泻、泽兰、生鸡内金、路路通、土鳖虫、水蛭走冲任而活血利水通胞络,祛瘀通滞;桔梗、乌药条畅气机,使气血冲任通畅,月经顺时而下,利于卵子排出,二者合用为佐药;甘草调和诸药为使。现代药理研究表明,紫石英、补骨脂等补肾药有类激素样作用,能改善POF引起的雌激素分泌不足,提高子宫内膜的容受性,改善宫颈黏液的分泌,利于精子通过[7]。补肾阳药可增强黄体功能,利于早期妊娠。活血化瘀药可使血管扩张,改善器官的血流量和高凝状态,稳定子宫和输卵管的内环境。因此,补肾药与活血化瘀通络药配伍有利于调经和助孕,是将中西病理、病机、药理融会贯通,也正是该方的灵魂所在。 实验结果显示,补肾活方可使卵巢和胸腺质量增加,卵巢指数上升,发育成熟卵泡较多,卵泡颗粒细胞层增多,卵巢间质淋巴细胞及浆细胞浸润减少。而颗粒细胞是卵巢周期激素合成的主要部位,表明补肾活血方的疗效机制是促进颗粒细胞合成,分泌E2并释放入血,发挥生物学效应,促进卵泡、子宫发育,使子宫、卵巢质量增加。胸腺是机体的免疫器官,经治疗后,各组胸腺指数均上调,胸腺细胞数量增加,使胸腺细胞发育过程中,对自身抗体应答的细胞被消除或抑制,从而形成对自身抗原的耐受性。由此可见,补肾活血方能调节和改善机体的免疫功能,但其作用机制有待进一步研究。
细胞凋亡的发生受多种基因表达的调控,以Fas/Fas-L系统为代表的死亡受体信号转导途径是其中的重要途径[8-9]。Fas是细胞表面重要的死亡受体,与其配体Fas-L结合后活化并传导凋亡信号,从而诱导表达Fas的靶细胞凋亡[10]。研究结果显示,模型组Fas mRNA表达明显高于正常组;与模型组比较,补肾活血方组Fas mRNA表达水平降低。表明Fas/Fas-L通路的激活可能是颗粒细胞凋亡的重要机制。本实验研究表明,补肾活血方对药物造成的卵巢早衰具有一定疗效,通过提高E2,降低LH、FSH的激素水平和抑制Fas、Fas-L基因的表达,从而改善卵泡颗粒细胞的凋亡来发挥作用。
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(收稿日期:2014-11-09)
(修回日期:2014-11-25;编辑:华强)