番鸭呼肠孤病毒检测技术研究进展

庄金秋 梅建国 王金良 姚春阳 王玉茂

摘  要：番鸭呼肠孤病毒病是危害养鸭业的一种重要传染病。本文概述了番鸭呼肠孤病毒（MDRV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面，主要依靠病毒分离培养、ELISA法、血清中和试验等病毒特异性抗原及其抗体的检测等。在分子生物学方面，主要依靠国内外相继建立起的RT-PCR技术、实时荧光定量RT-PCR技术、LAMP技术和核酸杂交技术等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性，为临床科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。

关键词：番鸭;呼肠孤病毒;检测;研究进展

中图分类号：S858.324.4+3     文献标识码：A     文章编号：1673-1085（2015）06-0050-06

番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）病俗称“肝白点病”、“花肝病”，是由番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭的一种以软脚、肝脾灰白色坏死点为特征的急性病毒性传染病。禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）和MDRV均是呼肠孤病毒科正呼肠病毒属的成员。正呼肠孤病毒属包括哺乳动物呼肠孤病毒和禽呼肠孤病毒。根据最新国际病毒学分类委员会第七次分类报告（2000）：哺乳类呼肠孤病毒（MRV）为I亚群，禽类呼肠孤病毒为II亚群，纳尔逊海湾病毒（NBV）和沸沸呼肠孤病毒（BRV）为III亚群。鸡感染ARV的临床症状表现为病毒性关节炎。MDRV主要危害10～40日龄的雏番鸭以及雏半番鸭，发病率和死亡率较高，日龄愈小病死率愈高，发病鸭耐过后生长发育受阻或成为僵鸭。该病主要影响番鸭的育雏及存活率，流行势态日趋严重，感染宿主范围不断扩大且有呈多致病型发生的态势，是危害番鸭养殖业的重要传染病之一，给番鸭养殖业造成了严重的经济损失。本文就近年来MDRV的实验室检测方法研究进展作一简要综述，以期为病毒的进一步深入研究和疾病的有效防控提供参考。

1  病毒分离与鉴定

MDRV可以在禽胚卵黄囊、尿囊腔和绒毛尿囊膜中复制增殖。初次分离MDRV通常选用卵黄囊途径接种禽胚，一般可在接种后3～5d致死胚，表现为胚胎蜷缩，胚体全身皮下出血，呈紫红色;肝、脾有时可见肿大和坏死;死亡胚尿囊液清亮等。MDRV也可以在多种禽胚原代细胞（肝、肺、肾和成纤维细胞等）培养物中增殖，其中最常用的是番鸭胚成纤维细胞（MDEF）和鸡胚成纤维细胞（CEF）。不同分离株的MDRV感染MDEF或CEF产生的病变有所差异：Malkinson等（1981）[1]证明MDRV能在MDEF上增殖，其细胞病变（CPE）为细胞融合和崩解;陈志胜等[2]（2005）、陈仕龙等[3]（2013）证明MDRV感染MDEF后细胞融合形成体积巨大含多个细胞核的合胞体，细胞质产生嗜酸性或嗜碱性包涵体;吴宝成等[4]（2001）证明其分离毒在MDEF和CEF上繁殖的CPE为细胞融合和崩解;胡奇林等[5]（2004）证明MDRV能在MDEF和CEF上繁殖，CPE为细胞圆缩和崩解，无细胞融合现象。MDRV病毒具有较广的细胞亲嗜性，能在鸡胚成纤维细胞的传代细胞系（DF1）、非洲绿猴肾细胞（vero）、恒河猴肾细胞（Marc145）、犬肾细胞（MDCK）、乳仓鼠肾细胞（BHK-21）、猪睾丸细胞（ST）、人胚肾细胞（AD293）等多种传代系细胞中增殖并产生CPE。待病毒增殖后可通过电镜观察其形态结构以及分析理化特性进一步对病毒进行鉴定。病毒分离与鉴定虽然十分准确可靠，但是存在整个操作过程比较复杂，耗时费力，而且常常出现病毒分离不成功或CPE长时间不出现的情况。

2  血清学方法

2.1  琼脂扩散试验（AGP）  AGP操作简单、快捷、便于推广，可用于检测MDRV的群特异性抗体，易于与其他病毒区分。该方法还可以用于病毒感染史的检测、分离株的鉴定以及血清学的监测等。王锡垄等[6]（1985）率先建立了AGP试验用于检测ARV抗原。随后，朱万光等[7]（1996）利用vero细胞、原代CEF细胞制备ARV的AGP抗原，建立了鸡病毒性关节AGP试验，用于鸡感染ARV的普查。陈士友等[8]（1991）、单松华等（1993）[9]先后建立了检测ARV抗体的AGP方法。AGP可以用于MDRV抗体的流行病学调查，但是该方法敏感性不高，不适用于检测低滴度的抗体。

2.2  血清中和试验（SN）  血清中和试验主要用于对MDRV进行血清型的鉴定，是经典的血清学检测方法。Kawamura[10]（1965）通过对其分离到的77株ARV进行SN试验并将这些毒株分为5个血清型。Wood等[11]（1980）认为ARV至少存在13个血清型。Robertson等[12]（1986）应用交叉中和试验发现各型间存在大量的交叉反应，因此有些只能作为亚型而不能作为独立的血清型。SN试验结果准确，但程序复杂，耗时费力，不能用于快速诊断及大批血清样品的检测。

2.3  免疫荧光试验（IF）  免疫荧光试验分为直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验（IFA），前者适用于感染组织中抗原的检测，后者可以用于抗原和抗体的检测。该方法与AGP相比更敏感，同时可用于病毒和ARV群特异性抗体的定量分析。肖成蕊等[13]（1990）制备了ARV荧光抗体，建立了检测ARV抗原的直接免疫荧光试验方法，对人工感染鸡和自然发病鸡的主要脏器进行检测，结果发现，肝脏和脾脏的检出率可达100%，而心脏和肾脏等的检出率为40%左右，说明该方法可以用于临床样品的检测，并且肝脏和脾脏是检测ARV的首选器官。王莹[14]（2010）、谢志勤等[15]（2012）也先后建立了检测ARV抗原的直接免疫荧光试验方法，表明该方法具有很好的特异性、重复性和稳定性。高春亮等[16]（2012）制备了具有免疫荧光特性的抗MDRV单克隆抗体，建立了检测MDRV抗原的间接免疫荧光（Mab-IFA）方法，表明该方法操作简便、特异性强、检测只需要2h，可用于MDRV感染的快速检测，为临床MDRV的快速诊断奠定了基础。

2.4  酶联免疫吸附试验（ELISA）  ELISA是目前应用最为广泛的一种免疫学监测方法。国内外已建立了检测MDRV抗原或抗体的多种ELISA方法，从而使大量样品的筛检更加快速化和自动化。Slaght等[17]（1979）最先建立了检测ARV抗体的ELISA方法。朱万光等[18]（1998）将ARV感染CEF和vero细胞后制备了ARV抗原，并建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法。Liu等[19]（2000）用σC和σA的单克隆抗体E9和H3，建立了Dot-ELISA方法，可检测细胞培养物和键组织样品中的ARV。Hung等[20]（2000）用纯化的σB蛋白作为包被抗原，建立了检测ARV抗体的σB-ELISA检测方法。该方法可以克服全病毒包板产生的非特异性，与SN相比，检测灵敏度更高。Liu等[21]（2002）用原核表达的σC和σB蛋白作包被抗原，建立了检测DRV抗体的σC-σB-ELISA检测方法，与SN的符合率达到100%，可以减少传统ELISA的非特异性结合。耿宏伟等[22]（2006）以原核表达的MDRV重组σC蛋白作为包被抗原，建立了检测鸭血清中MDRV抗体的间接ELISA方法。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测，与AGP法相比，ELISA具有良好的特异性和敏感性，为MDRV抗体检测试剂盒的研制和应用奠定了基础。邹光盛[23]（2007）、张云等[24]（2008）、孙美玉[25]（2012）也先后建立了σC蛋白为抗原的检测DRV抗体的间接ELISA方法，具有较高的临床使用价值，可以用于DRV感染的流行病学调查以及群体DRV抗体水平的诊断和监控。Yang等[26]（2010）通过在酵母中表达的σC和σB蛋白作为包被抗原，建立了用于检测ARV抗体的ELISA方法。共建立了两种试剂盒，分别为1071的σC蛋白和S1133的σB蛋白等量混合作为抗原以及S1133 σC-σB融合蛋白作为抗原，结果表明建立的ELISA方法比常规ELISA具有更高的阳性率。Chen等[27]（2004）建立了非结构蛋白σNS的单克隆抗体（MAb）捕获ELISA方法用以检测ARV抗体。该方法比常规ELISA的非特异性结合更低，免疫过灭活苗的呈阳性，可用于ARV灭活苗的免疫状况监测。谢芝勋等[28]（2007）以非结构蛋白P17建立了P17-ELISA检测方法，可用于鉴别ARV灭活疫苗免疫和活病毒感染。Xie等[29]（2010）利用原核表达的非结构蛋白σNS和P17建立了检测抗体的ELISA方法，该方法可用于区分疫苗免疫的鸡群和野毒感染的鸡群。秦宇[30]（2005）、谢芝勋等[31]（2007）先后以表达的ARV σ3融合蛋白纯化后作为抗原，建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法。秦春香等[32]（2009）建立了能检测ARV抗体的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2两个蛋白同时包被的σ3-σ2-ELISA检测方法。分别用上述3种方法对制备的33份ARV SPF鸡阳性血清进行检测，结果阳性检出率分别为90.91%、69.70%和100%。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。谢志勤等[33]（2013）建立了检测ARV抗原的双抗体夹心ELISA方法。孙陈莉[34]（2013）分别建立了检测MDRV抗原和抗体的方法，包括两个方面：一是以大肠杆菌表达的MDRV σB蛋白作为包被抗原，建立检测MDRV抗体的间接ELISA方法;二是研制针对MDRV的单克隆抗体，建立了检测MDRV抗原的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）方法。焦玉兰等[35]（2013）通过氯仿抽提卵黄抗体方法，经ELISA法检测鸡卵黄和血清中ARV抗体的相关性试验，确定卵黄抗体和血清抗体的对应关系，并依此建立了ELISA试剂盒检测卵黄抗体的检测方法及判定标准。虽然采用ELISA作为诊断手段具有快速、敏感、特异的优点，但由于存在血清型之间交叉反应性强弱的问题，容易造成漏诊或误诊。

2.5  乳胶凝集试验（LAT）  LAT简便、快速、敏感，特异，既可以从攻毒或鸭的粪便中检出MDRV抗原，又可以检测血清中的抗体。王全溪[36]（2004）建立了检测MDRV抗原的反向LAT方法，适合于兽医基层临床对MDRV的检测。但是该方法需要特定的条件，而且与ARV鸡源毒株发生凝集反应，特异性不是很好。吴异健等[37]（2005）用纯化的抗MDRV抗体致敏乳胶成功地建立了检测MDRV的反向LAT方法。结果表明，MDRV抗体致敏的乳胶无自凝性，特异性强，重复性好，质量可靠。检测10份MDRV尿囊液与AGP方法进行比较，二者的阳性符合率为100%，这对临床上诊断与防治MDRV感染具有重要的参考意义。韩典霖[38]（2007）利用原核表达、纯化的MDRV-YB株的重组σC蛋白作为抗原致敏乳胶，建立了检测MDRV抗体的LAT方法，该方法检测抗体的敏感性高、特异性强、稳定性好。

2.6  免疫组化技术  免疫组化法是一种使用标记的抗体对细胞或组织中的特异性抗原进行定性和定位检测的方法，其中酶标法应用最为广泛应用，具有敏感性高、特异性强且可以检测组织中极微量的病原体等优点。包汉勋等[39]（2009）利用纯化的兔抗MDRV多克隆抗体，建立了检测MDRV的间接酶免疫组化方法。应用该法对雏番鸭人工感染MDRV，研究MDRV在番鸭体内的分布规律，结果表明病毒对肝脏、脾脏、盲肠的组织嗜性最强，为该病毒的主要靶器官，这为阐明MDRV感染的发病机理提供了理论依据。王全溪等[40]（2009）通过对雏番鸭人工感染MDRV后，采用免疫组织化学技术检测外周血淋巴细胞转化率，证实MDRV可以诱导免疫抑制。

3  分子生物学方法

3.1  RT-PCR技术  RT-PCR技术快速、敏感、特异性强，已被广泛应用于MDRV的检测。Lee等[40]（1998）通过对ARV的S3基因设计引物，建立了RT-PCR方法，最低可以检测到0.2pg的RNA。谢芝勋等[41]（2001）根据S1133株Sl基因序列设计两对引物，建立了检测ARV的半巢式RT-PCR，最低能检测到1pg的病毒RNA。廖敏等[42]（2004）建立的一步法RT-PCR最低则能检测到0.16ng的病毒RNA。胡奇林等[43]（2004）建立了检测MDRV的RT-PCR方法，检测灵敏度为1pg，但检测的样品须为细胞毒或尿囊液，不能检组织病料，病毒培养需要时间长，因此不适合作为临床快速诊断的手段。Liu等[44]（2004）建立了一种RT-PCR结合限制性片段长度多态性分析（RFLP）的方法，有助于鉴定禽群中是否存在变异株，或检测特定株在禽群中的水平传播情况。Bruhn等[45]（2005）根据ARV 52和54基因建立的RT-PCR方法，适用于检测疫苗中污染的外源ARV。林锋强等[46]（2007）建立了半套式RT-PCR方法检测MDRV，敏感度达1pg，检测人工感染MDRV的样品和临床疑似样品与病毒分离相比较，二者的符合率为100%。王劭等[47]（2011）建立了RT-PCR方法检测NDRV，敏度达2pg。李启强[48]（2012）建立了检测MDRV的套式RT-PCR方法，灵敏度可达0.1pg。周五朵等[49]（2014）根据MDRV YB株P10蛋白基因和YJL株P17蛋白基因分别设计了2对特异性引物，建立了可鉴别诊断2个毒株的双重PCR方法，为临床检测ARV、MDRV提供借鉴，对生产具有很强的实用性。卿柯香等[50]（2014）根据S3基因设计引物，建立了能够同时快速检测MDRV和NDRV的双重RT-PCR方法。

3.2  荧光定量RT-PCR技术  荧光定量PCR与传统的PCR相比，能有效减少试验中的污染，具有检测快速、批量、灵敏度高、特异性强、可以定性和定量检测等优点。Guan等[51]（2006）在RT-PCR的基础上，建立了能定量研究ARV的Light Cycler荧光定量PCR方法，该方法的灵敏度是常规RT-PCR方法的1000倍以上，且不需要进行巢式PCR的二次加样，能很好地避免加样造成的污染。童桂香等[52]（2007）应用SYBR Green I染料法在ARV σC蛋白序列的保守区设计引物，建立了荧光定量RT-PCR方法，该方法检测病毒RNA的量可达到5.2×102个拷贝，具有较高的灵敏度，但是荧光染料能与非特异的双链DNA结合，使试验产生假阳性信号。严进等[53]（2009）根据MDRV的σNS基因序列设计引物及TaqMan探针，建立了TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法，可以检测到1.0×102拷贝/μl的标准品，比普通PCR至少高100倍。该方法对MDRV人工感染番鸭肝脏组织检出率达到100%。熊文婕等[54]（2010）建立了定量检测ARV σC和σNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。孙美玉[55]（2012）建立了针对ARV σC基因TaqMan荧光定量RT-PCR方法。Guo等[56]（2011）建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法可检测到5个拷贝/μl的标准品，灵敏度约为常规RT-PCR的150倍，相比Light Cycler荧光定量PCR方法，既能满足检测的要求，也能进行病毒的定量分析。杨旭[57]（2011）建立了检测MDRV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，对收集的80份人工感染样品和10份临床样品分别用常规RT-PCR和建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测。结果显示，人工感染样品中，荧光定量RT-PCR检出率（52.5%）高于常规RT-PCR（45%）;临床样品中，荧光定量RT-PCR检出率（60%）也高于常规RT-PCR（30%）。表明其所建立的荧光定量RT-PCR比RT-PCR敏感性高，可以为MDRV感染提供快速而准确的诊断方法。袁远华等[58]（2013）建立了针对新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）S3基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法，可以实时定量分析病毒核酸在动物体内的含量，从而明确NDRV感染程度，并能够为NDRV的早期检测提供重要参考。

3.3  环介导等温扩增技术  环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）在灵敏度、特异性、扩增时间、检测范围上都优于常规PCR技术，而且不需要精密仪器，一般用恒温水浴锅就可以在短时间内进行目的片段的扩增，检测成本低于荧光定量PCR，该方法简便快捷，省时省力，是一种适用于基层实验室快速、准确检测MDRV的方法。董嘉文等[59]（2011）针对ARV S1基因设计1套LAMP引物，建立了检测ARV的LAMP方法。马利等[60]（2013）使用2种荧光显色剂（SYBR Green Ⅰ和钙黄绿素）建立了检测ARV的LAMP方法。在对80份临床样本的检测中，使用LAMP和PCR检测出阳性样本的数量分别为68份和55份。认为基于荧光显色的LAMP方法可以应用于ARV的快速检测，具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力。

3.4  核酸探针技术  核酸探针技术是在己获得的病毒特异片段上标记放射性同位素或生物素作为探针而建立的一种分子杂交方法，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具，已被广泛应用于ARV的检测上。Liu等[61]（1997）通过地高辛标记建立的cDNA探针技术，可直接检测组织切片及细胞中的微量RNA，最低检测量为0.78ng。该方法不仅能定位感染组织中的ARV，还能在临床症状出现前检测到ARV，具有较高的灵敏性。Yin等[62]（1998）建立的以放射性32P标记的核酸探针，最低检测剂量达0.2ng，特异性较强，但该放射性探针具有使用不安全的缺点，很难推广。谢芝勋等[63]（2001）也建立了地高辛标记的cDNA探针技术，但其灵敏度较Liu建立的方法高，最低检出量为0.45ng。造成这种差异的原因可能与探针的设计存在关系。王蕾等[64]（2007）用地高辛标记ARV S1基因中编码σC蛋白的基因片段作为核酸探针，在斑点分子杂交中可检测到1.6pg的RNA。表明其建立的核酸探针检测方法灵敏度高、特异性强和操作简便，适于批量样品的检测。核酸探针技术敏感，但操作较繁琐，适用于实验室检测及其出入境动物的检疫。

4  小结

MDRV在我国番鸭群中普遍存在，常常与其他细菌或病毒的继发感染或并发感染，引起常规疫苗的免疫效果不佳。MDRV和AIV对法氏囊均有一定程度的免疫抑制，共感染后引发更为严重的免疫抑制，对于防控禽流感将是更严峻的问题。因此，做好番鸭呼肠孤病的防控将会对其他疾病起到积极的作用。另外，MDRV和NDRV在流行病学、临床症状和病理变化等方面存在较大差异。MDRV易感动物主要是雏番鸭，而NDRV的宿主范围较广，各品种鸭都易感。明确这两种不同疾病型水禽呼肠孤病毒病的病原学特征，将为研究两病毒引起的致病性差异的机制奠定基础，也为水禽呼肠孤病毒病的有效防控和实用疫苗的设计提供科学依据。黄瑜等[65]（2009）将我国感染MDRV相关的疾病归结为4种，即鸭多脏器坏死症、多脏器出血症、肝坏死症和脾坏死症。导致这一结果的因素，很可能与病毒的毒力、基因型、血清型、抗原性、组织亲嗜性或者致病性等有关。建立快速、准确的检测方法，进行分子流行病学调查，开发有针对性的新型疫苗等防控产品，是控制该病频发和暴发的基础和关键，具有十分重要的意义。上述MDRV的血清学和分子生物学检测方法各有优点和缺点，需要根据不同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方法。虽然上述检测方法为MDRV的检测提供了有效的技术手段，但是随着人们对MDRV深入研究，相信现有的检测方法将不断的得到改进或者新的检测方法将很快研制出来，以使其检测技术更简便化、快速化和准确化，这将对番鸭呼肠孤病毒病的有效防控产品及技术的研制奠定基础。

参考文献：

[1]  Makinson M，Perk K，WeismanY. Reovirus infeetion of young museovy ducks[J].AVianPathol，1981，10：433-440.

[2]  陈志胜，马春全，卢玉葵，等.番鸭呼肠孤病毒诱导雏番鸭免疫器官细胞凋亡的研究[J].中国预防兽医学报，2005，（6）：4-6.

[3]  陈仕龙，陈少莺，林锋强，等.两株不同疾病型鸭呼肠孤病毒部分生物学特性的比较[J].福建农业学报，2013，28（1）：1-4.

[4]  吴宝成，陈家祥，姚金水，等. 番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J].福建农林大学学报，2001，30（2）：227-230.

[5]  胡奇林，陈少莺，林锋强，等.番鸭呼肠孤病毒的鉴定[J].病毒学报，2004，20（3）：241-248.

[6]  王锡垄，唐秀英，张庆祥，等.应用琼扩试验检查鸡病毒性关节炎[J].家畜传染病，1985，20（3）：26-27.

[7]  朱万光，杜元钊，刘佩兰，等.鸡病毒性关节炎病毒的分离与鉴定[J].中国兽医科技，1996，62（2）：3-4.

[8]  陈士友，陈敷言，蔡宝祥，等.用琼脂扩散试验检测鸡呼肠孤病毒抗体[J].畜牧与兽医，1991，23（3）：108-109.

[9]  单松华，胡永强，邬宝官，等.鸡病毒性关节炎琼脂扩散抗原制备方法的比较及应用[J].动物检疫，1993，10（5）：6-8.

[10]  Kawamura H，Shimizu F，Maeda M，et al. Avian reovirus：Its properties and serological classification[J]. Natl Inst Anim Hlth Q，1965，5，124.

[11]  Wood GW，Nicholas RAJ，Hebert CN，et al. Serological comparisons of avian reoviruses[J].J Comp Pathol，1980，90：29-38.

[12]  Robertson MD and Wilcox GE. Avian reovirus[J]. Vet Bull，1986，56：759-766.

[13]  肖成蕊，梁基，郭翠莲，等.免疫荧光技术诊断鸡病毒性关节炎的研究[J].中国兽医科技，1990，9（9）：6-8.

[14]  王莹.禽呼肠孤病毒LAMP检测方法和直接免疫荧光检测方法的研究[D].南宁：广西大学，2010，1-56.

[15]  谢志勤，谢芝勋，刘加波，等.直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立[J].中国动物检疫，2012，29（11）：35-39.

[16]  高春亮，蔡羲，朱小丽，等.间接免疫荧光方法快速检测番鸭呼肠孤病毒病[J].畜牧兽医杂志，2012，31（4）：8-13.

[17]  Slaght SS，Yang TT and Van der Heide. AdoPtion of enzyme-linked immunosorbent assay to the avian system[J].Journal of Clinical Microbiology，1979，10：698-702.

[18]  朱万光，刘雁征，吴延功，等.用酶联免疫吸附试验检测鸡病毒性关节炎抗体的研究[J].中国动物检疫，1998，15（2）：11-12.

[19]  Liu HJ，JosePh JG，Yong HW，et al. The use of monoclona lantibody Probes for the detection of avian reovirus antigens[J].Joumal of Viro1ogical methods，2000，86：115-119.

[20]  Hung SH，Yin HS，Lee LH.An enzyme-linked inununosorbent assay for the deteetion of antibody to avian reovirus by Protein sigmaB as the coating antigen[J].Res Vet Sci，2000，69（2）：107-112.

[21]  Liu HJ，Liam CK，Yu CH，et al.Development of an ELISA for detection of antibodies to avian reovirus in chickens[J].Joumal of Virologieal Methods，2002，102：129-138.

[22]  耿宏伟，郭东春，张云，等.以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科学，2006，36（3）：171-176.

[23]  邹光盛.番鸭呼肠孤病毒σC基因真核表达及其间接EL1SA方法的建立[D].福州：福建农林大学，2007，31-41.

[24]  张云，耿宏伟，郭东春，等.以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA方法的建立[J].水禽世界，2008，1（1）：34-39.

[25]  孙美玉.禽呼肠孤病毒检测方法的建立及病毒分离鉴定[D].北京：中国农业科学院，2012，16-28.

（[26-65]参考文献略）