钙元素对冬季迟缓期的艾纳香生物量和有效成分含量的影响

摘 要 以一年生艾纳香种子苗为实验材料，用一水合氯化钙提供钙元素，在冬季艾纳香生长迟缓期进行3次施肥，测定艾纳香的株高、地径、叶长和叶宽等生长指标以及生物量。采用紫外可见分光光度法测定艾纳香不同部位中总黄酮的相对含量，并计算总黄酮的绝对含量；采用GC测定艾纳香叶片中l-龙脑的相对含量，并计算l-龙脑的绝对含量。结果表明：钙元素极显著增加了冬季生长迟缓期的艾纳香叶、茎和根生物量，其中5 g/L钙处理组的艾纳香叶生物量极显著高于其他3个处理组，10、15 g/L钙处理下的叶生物量极显著高于空白对照组（CK），分别是对照的3.03倍和2.65倍。钙元素的施加抑制了艾纳香不同部位总黄酮相对含量的积累，然而显著增加了总黄酮绝对含量。5 g/L钙处理组的l-龙脑相对含量和绝对含量最高，分别为0.22%和0.22 g，与10、15 g/L钙和CK组相比，分别增加了37.50%、22.22%、37.50%和100%、100%、450%。在冬季艾纳香生长迟缓期施加钙元素可以显著促进艾纳香叶、茎和根生物量的积累，提高总黄酮和l-龙脑的绝对含量。

关键词 钙；艾纳香；迟缓期；l-龙脑；总黄酮；生物量

中图分类号 Q949.783.5 文献标识码 A

Abstract The one-year-old seedlings of Blumea balsamifera（L.） DC. were applied with CaCl2·H2O which supplied Ca in slow growth period of winter three times. The height，ground diameter，length of leaf，width of leaf and biomasses were measured. Then，the relative contents of total flavones in different parts of B. balsamifera were determined by UV and the absolute contents of total flavones were calculated. The relative contents of l-borneol in leaves of B. balsamifera were determined by GC and the absolute contents of l-borneol were calculated. The Ca element significantly enhanced the biomasses of leaves，stems and roots. The biomass of leaves under 5 g/L Ca treatment group was the highest. The leaves biomasses under 10 and 15 g/L Ca treatment groups were significantly higher than that in the control（CK）group，with 3.03 and 2.65 times. The application of Ca inhibited the accumulation of total flavones relative contents in different parts. However，it could promote the accumulation of total flavones absolute contents. The relative and absolute contents of l-borneol of 0.22% and 0.22 g under 5 g/L Ca treatment group were the highest，which was higher with 37.50%，22.22%，37.50% and 100%，100%，450%，compared with 10，15 g/L Ca and CK treatment groups，respectively. The Ca element could promote significantly the accumulation of biomasses of leaves，stems and roots，as well as the absolute contents of total flavones and l-borneol in B. balsamifera in slow growth period of winter.

Key words Calcium（Ca）；Blumea balsamifera；Slow growth period；l-borneol；Total flavones；Biomass

艾纳香为菊科多年生木质草本植物艾纳香Blumea balsamifera（L.）DC.的新鲜或干燥地上部分，具有祛风除湿、温中止泻、活血解毒之功效[1-2]。广泛分布于中国的海南、贵州、云南等省份[3]。艾纳香中主要含有挥发油类和黄酮类成分，其挥发油类主要成分为l-龙脑（l-borneol）[4-6]。目前，艾纳香主要作为艾片（天然冰片）和艾纳香油的原料被广泛使用[7-9]。由于近年来人们对艾片和艾纳香油需求的不断增加，导致野生艾纳香资源已不能满足生产的需要，因此，人工栽培艾纳香成为解决这一问题的必然途径。多年来的研究发现，栽培艾纳香中有效成分l-龙脑和总黄酮含量及其药材产量均低于野生艾纳香，而施肥是提高中药材产量和质量的有效手段之一[10]。目前，在艾纳香道地产区贵州省罗甸等地很少给栽培艾纳香施肥或仅施少量钙镁磷肥。有关艾纳香施肥的研究较少，何元农等[11]给艾纳香施用农家肥圈肥、油枯和柴、一元化肥尿素、过磷酸钙和氯化钾以及复合肥，结果表明施肥组的经济产量和生物产量均高于对照组，且其有效成分含量不减，其中氮肥对生物产量增加作用明显；得油率和l-龙脑含量与钾肥用量呈正相关关系，二者与磷肥的直接关系不显著。何元农等[12]研究发现氮肥可以提高艾纳香药材的产量及其有效成分的含量。王丹等[13]研究发现，锰元素极显著地提高冬季生长迟缓期的艾纳香生长指标和生物量，对l-龙脑和总黄酮相对含量的提高无显著影响，但是极显著提高了其绝对含量。因此，在获得较高产量的同时，如何提高有效成分的含量，是亟待解决的问题。

钙是植物所必需的中量元素，地上部分的钙较多，茎叶尤其是老叶中含钙量较高。钙元素是细胞壁的重要成分，可以稳定生物膜，调节养分离子的生理平衡、酶促作用以及促进细胞伸长[14-15]。因此，在本课题组前期研究的基础上，在海南冬季艾纳香生长的迟缓期，研究不同浓度的钙元素对艾纳香生长指标、生物量及其有效成分相对含量和绝对含量的影响，以期为后续艾纳香专用肥研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及预处理 选择一年生艾纳香种子苗，被中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新副研究员鉴定为艾纳香Blumea balsamifera（L.）DC.。于2014年1月27日每隔10 d给艾纳香叶面喷施钙肥，共施肥3次。于2014年3月7日取样。以一水合氯化钙（CaCl2·H2O）提供钙元素，分别设置5、10、15 g/L 3个浓度；另设空白对照组（CK），即不进行任何处理。

1.1.2 试验仪器 7890A气相色谱仪（美国安捷伦科技公司），FID氢火焰离子化检测器（美国安捷伦科技公司），G4513A 16位自动进样器（美国安捷伦科技公司），2012-PCS紫外分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司），CPA225D电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），KQ-500DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；左旋龙脑对照品（阿法埃莎化学有限公司，批号为10147015，纯度>98%），芦丁标准品（中国药品生物制品检定所，批号为100080-200707，纯度为92.5%）；水杨酸甲酯（天津光复精细化工研究所），乙酸乙酯、甲醇、氢氧化钠（西陇化工股份有限公司），亚硝酸钠（国药集团化学试剂有限公司），一水合氯化钙、九水合硝酸铝（广州化学试剂厂），均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 生长指标的测定 将艾纳香的植株按照根、茎、叶分别进行取样，用直尺和卷尺分别测量株高、叶长和叶宽，使用电子游标卡尺测量地径，用天平分别测量其生物量。

1.2.2 总黄酮相对含量测定 （1）对照品溶液的配制及标准曲线的制备：对照品溶液的配制以及标准曲线的制备同王丹等[13]的方法。

（2）供试品溶液的制备：分别准确称取阴干后的艾纳香叶、茎和根（过20目筛）粉末1.000 0 g，放入具塞锥形瓶中，加甲醇溶液50 mL，称定重量；冷浸30 min后，在超声频率为80 Hz的超声清洗器中超声提取30 min；放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀后过滤，取滤液作为供试品。

（3）总黄酮相对含量测定：按照（2）项的方法进行样品溶液制备，接着测定供试品吸光度值，计算得出艾纳香不同部位总黄酮相对含量。艾纳香不同部位总黄酮相对含量是指艾纳香不同部位中每100个单位质量所含总黄酮的单位质量数，为质量百分数，单位为%。

1.2.3 总黄酮绝对含量计算 总黄酮的绝对含量为单株艾纳香总黄酮产量，指单株艾纳香不同部位中所含总黄酮的质量，单位为g。

总黄酮绝对含量/g=不同部位总黄酮相对含量/100×对应部位药材生物量

1.2.4 l-龙脑相对含量测定 采用GC法测定艾纳香叶片中l-龙脑相对含量，具体见王丹等[13]的方法。

1.2.5 l-龙脑绝对含量计算 l-龙脑的绝对含量为单株艾纳香l-龙脑产量，指单株艾纳香不同部位中所含总l-龙脑的质量，单位为g。

l-龙脑绝对含量/g=不同部位l-龙脑相对含量/ 100×对应部位药材生物量

1.3 数据分析

采用Excel进行数据录入及图表的绘制，采用SPSS 16.0软件进行数据统计与One-way ANOVA方差分析，并用Duncan检验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 钙元素对艾纳香生长指标的影响

方差分析结果表明，不同浓度的钙处理组，艾纳香株高、地径、叶长和叶宽在各处理间差异均不显著（p>0.05）。由表1可见，与CK处理相比，5、10、15 g/L钙处理组的叶长均高于CK组，分别增加了42.69%、18.50%和20.05%。

2.2 钙元素对艾纳香生物量的影响

方差分析结果表明，不同浓度的钙处理组，艾纳香叶、茎和根的生物量在各处理间差异极显著（p<0.01）。由图1可见，其中5 g/L钙处理组的艾纳香叶生物量极显著高于其他3个处理组，10、15 g/L钙处理组的叶生物量极显著高于CK组，分别是CK处理叶生物量的3.03倍和2.65倍。5、10 g/L钙处理组的茎生物量分别为76.71、76.15 g，极显著高于15 g/L钙处理组（53.79 g）和CK处理组（36.57 g），分别增加了42.61%、109.72%和41.57%、108.23%。5、10、15 g/L钙处理组的艾纳香根生物量极显著高于CK组。

2.3 钙元素对艾纳香不同部位总黄酮含量的影响

2.3.1 钙元素对艾纳香不同部位总黄酮相对含量的影响 方差分析结果表明，不同浓度的钙处理组，艾纳香叶、茎和根中总黄酮相对含量在各处理间差异极显著（p<0.01）。由图2可见，CK组的艾纳香叶总黄酮相对含量最高，为2.23%，极显著高于其他3个处理组，与5、10、15 g/L钙处理组相比，分别增加了57.04%，84.30%和67.67%。CK组的艾纳香茎总黄酮相对含量显著高于5、10、15 g/L钙处理组。5、10 g/L钙和CK处理组根总黄酮含量高于15 g/L钙处理组。

2.3.2 钙元素对艾纳香不同部位总黄酮绝对含量的影响 方差分析结果表明，不同浓度的钙处理组，艾纳香叶和根中总黄酮绝对含量在各处理间差异极显著（p<0.01），茎总黄酮绝对含量在各处理间差异显著（p<0.05）。由图3可见，5 g/L钙处理组艾纳香叶总黄酮绝对含量为1.37 g，显著高于其他3个处理，与10、15 g/L钙和CK组相比，分别增加了65.06%、73.42%和174.00%，差异极显著。5 g/L钙处理下茎总黄酮绝对含量显著高于10、15 g/L钙处理组。5和10 g/L钙处理组根总黄酮绝对含量显著高于15 g/L钙处理和CK组。

2.4 钙元素对艾纳香叶片中l-龙脑相对和绝对含量的影响

方差分析结果表明，不同浓度的钙处理组，艾纳香叶中l-龙脑相对含量在各处理间差异不显著，l-龙脑绝对含量在各处理间差异极显著（p<0.01）。由表2可见，5 g/L 钙处理组的l-龙脑相对含量和绝对含量最高，分别为0.22%和0.22 g，与10、15 g/L钙处理组和CK组相比，分别增加了37.50%、22.22%、37.50%和100%、100%、450%。

3 讨论与结论

钙是植物生长发育所需要的营养元素之一，是植物细胞壁的重要成分，可促进细胞伸长，调节植物体内养分离子的平衡，并且还可以消除某些离子的毒害作用[16]。钙可以显著增加胡椒、油菜、苜蓿、大豆、烤烟等作物的产量[17-20]。何元农等[21]研究证实1～2月是艾纳香生长迟缓期，3月为恢复生长期。本研究于海南冬季艾纳香生长的迟缓期研究钙元素的肥效，经对比发现，未施加钙元素处理（CK）的艾纳香幼苗生长迟缓，大部分的植株停止生长，有些植株的叶片已脱落。施加钙元素的艾纳香植株生长较好，叶宽和叶长增加比较明显，其中5 g/L钙处理组的叶宽和叶长显著高于CK处理。钙元素显著提高了艾纳香根、茎和叶的生物量，这主要与钙元素的生理作用息息相关，即可以促进植物细胞伸长，促进艾纳香的生长和生物量的积累，其中5、10 g/L钙肥效较明显。因此，在海南冬季艾纳香生长的迟缓期需要施加适量的钙肥，有利于促进艾纳香植株生长和生物量的积累，显著提高药材产量。

同时，本研究发现施加钙元素对艾纳香不同部位的总黄酮相对含量的积累有一定的抑制作用，降低了叶片和茎中总黄酮的相对含量。总黄酮是艾纳香中黄酮类物质的总和，是次生代谢产物，而植物次生代谢过程是一个持续而动态的过程，并且在这一过程中对营养元素的需求也各有差别。10～11月是海南产艾纳香总黄酮相对含量积累的高峰期，而1～2月总黄酮积累比较缓慢，相对含量较低。因此，本研究结果可能是由于冬季艾纳香处于生长迟缓期，钙元素对次生代谢产物的积累影响不明显，总黄酮相对含量的积累受到一定的抑制作用，对艾纳香初生代谢影响较大，进而导致总黄酮绝对含量（即单株艾纳香叶片中总黄酮的积累量）显著增加。钙结合在钙调蛋白上，可以活化植物体内多种关键酶，进而对细胞代谢起到调节作用[22]。通过本研究发现，在海南的冬季，低浓度5 g/L钙元素显著提高了艾纳香叶片中l-龙脑的相对含量，对l-龙脑绝对含量的提高也有显著的促进作用；钙元素对艾纳香叶片中l-龙脑相对含量的影响不显著，但是却显著增加了l-龙脑的绝对含量（即单株艾纳香叶片中l-龙脑积累量）。综上所述，在海南冬天艾纳香生长的迟缓期，施加钙元素可以显著提高艾纳香药材的产量，但对艾纳香药材的质量（即有效成分的相对含量）不仅无促进作用，反而抑制其积累，因此在以获得药用成分为目的的艾纳香栽培中不建议使用。但是，如果从以艾纳香作为提取精油的原料方面考虑，施加钙元素可以显著提高艾纳香药材的产量和有效成分的绝对含量，即可以提高精油的产量，具有实际的使用价值和意义。本研究为艾纳香专用肥的研究提供了理论依据。本课题后续将研究艾纳香不同生长期的钙肥肥效，进而确定钙肥的最适宜施肥时期、施用量及艾纳香的最佳采收季节。

参考文献

[1] 庞玉新， 谢小丽， 陈振夏， 等. 艾纳香本草考[J]. 贵州农业科学， 2014， 42（6）： 10-13.

[2]王 丹， 付万进， 庞玉新， 等. 艾纳香油过敏性和急性毒性实验研究[J]. 热带作物学报， 2013， 34（12）： 2 499-2 502.

[3]袁 媛， 庞玉新， 王文全， 等. 中国艾纳香属植物资源与民族药学研究[J]. 热带农业科学， 2011， 31（4）： 22-27.

[4] Pang Y X， Wang D， Fan Z W， et al. Blumea balsamifera-A Phytochemical and Pharmacological Review[J]. Molecules， 2014， 19： 9 453-9 477.

[5] Saewan N， Koysomboon S， Chantrapromma K. Anti-tyrosinase and anti-cancer activities of flavonoids from Blumea balsamifera DC [J]. J Med Plants Res， 2011， 5（6）： 1 018-1 025.

[6] Nessa F， Ismail Z， Mohamed N. Xanthine oxidase inhibitory activities of extracts and flavonoids of the leaves of Blumea balsamifera[J]. Pharm Biol， 2010， 48（12）： 1 405-1 412.

[7] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部）[S]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010.

[8]庞玉新， 王文全， 张影波， 等. 药用植物艾纳香基因组DNA提取方法研究[J]. 广西植物， 2009， 29（6）： 763-767.

[9] 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M]. 上海： 上海科学技术出版社， 1999， （7）： 738.

[10] 王 丹， 侯俊玲， 万春阳， 等. 中药材施肥研究进展[J]. 土壤通报， 2011， 42（1）： 225-228.

[11]何元农， 丁 映， 洗福荣， 等. 肥料种类对艾纳香生物产量和有效成分含量的影响[J]. 贵州农业科学， 2005， 33（5）： 53-57.

[12]何元农， 丁 映， 冼福荣， 等. 艾纳香产量和有效成分含量对氮素营养的反应[J]. 贵州农业科学， 2006， 34（2）： 28-30.

[13]王 丹， 庞玉新， 陈振夏， 等. 锰元素对冬季迟缓期的艾纳香幼苗生物量和有效成分含量的影响[J]. 广东农业科学， 2014， 41（21）： 26-30.

[14]陆景陵. 植物营养学（上册）[M]. 北京：中国农业大学出版社， 2003： 61-66.

[15] 申 沛. 钙对黄姜产量和皂素含量的影响[D]. 武汉： 华中农业大学， 2001： 6.

[16] 孙 羲. 植物营养原理[M]. 北京： 中国农业出版社， 1991.

[17]孙光明， 许能馄， 蔡裕行， 等. 胡椒施用白云石灰和微量元素的效果初探[J]. 热带亚热带土壤科学， 1996， 5（2）： 116-119

[18] 周 卫， 林 葆. 植物钙素影响机理研究进展[J]. 土壤学进展， 1995， （2）： 12-17.

[19] 吴明才， 肖昌珍. 大豆钙素营养[J]. 中国油料作物学报， 1998， 20（3）： 60-64.

[20]程 森， 吴家森， 王 平， 等. 烤烟烟叶卷曲症状的诊断及其机理研究I.症状的发现、初步诊断及机理假设[J]. 土壤学报， 2007， 44 （5）： 956-959.

[21]何元农， 丁 映， 冼福荣， 等. 艾纳香生长发育特性的初步观测[J]. 贵州农业科学， 2005， 33（2）： 19-23.

[22]何忠俊， 曾 波， 韦建荣， 等. 钙对滇重楼生长和总皂甙含量的影响[J]. 云南农业大学学报（自然科学版）， 2010， 25（5）： 664-669.