海南省芒果畸形病的发现与鉴定

张贺　韦运谢　漆艳香　刘晓妹　谢艺贤　喻群芳　蒲金基

摘 要 从海南省东方市、三亚市采集芒果畸形病组织，运用柯赫氏法则证实分离物为该病的致病菌。采用Fusarium mangiferae的特异性鉴别引物1-3F/R和AF1对致病菌进行PCR鉴别，结合形态特征将其鉴定为F. mangiferae，这是芒果畸形病在海南省的首次报道。

关键词 Fusarium mangiferae；芒果畸形病；海南省

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

Abstract Mango tissue samples infected by malformation disease were collected from Dongfang City and Sanya City， Hainan. Isolate MMD-30 was confirmed to be the pathogen of the disease through Koch's postulates. Based on species-specific PCR analysis with the primers 1-3 F/R and AF1 for Fusarium mangiferae， combined morphological identification， the isolate was confirmed to be F. mangiferae. This is the first discovery and identification of mango malformation disease caused by F. mangiferae in Hainan.

Key words Fusarium mangiferae；Mango malformation disease；Hainan

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.019

芒果（Mangifera indica L.）隶属漆树科芒果属，是世界五大著名热带水果之一。中国芒果种植历史悠久，是目前种植芒果87个国家之一，主要分布于台湾、海南、广西、广东以及云南、四川、福建、贵州等热带、亚热带地区[1]。芒果在生长过程受多种病害的危害，制约着芒果产业的健康发展。芒果畸形病（Mango Malformation Disease，MMD）在世界范围内普遍发生危害，平均产量损失达50%～80%，严重时植株完全绝产[2]。芒果畸形病有多种病原菌，如Fusarium mangiferae，F.sterilihyphosum，F.proliferatum，F.tupiense和F.mexicanum，其中以F. mangiferae为世界性广泛分布的病原菌[3]，对芒果产业的威胁最大。为了更有效、更简便地对F. mangiferae进行鉴定，Zheng和Ploetz[4]采用RAPD的方法获得该菌的特异性片段，并在此基础上设计特异性引物1-3F/R，用于F. mangiferae的鉴定。Crespo等[5]应用该引物成功地对西班牙阿萨尔基亚（Axarquia）地区的芒果畸形病进行了鉴定。Newman等[6]利用AFLP技术获得F. mangiferae的特异性片度，设计AF1、RD4等多条特异性鉴定引物用于病原菌的鉴定。芒果畸形病于1891年首次在印度比哈尔邦发现[7]，随后在非洲、亚洲和美洲等芒果产区均有发生[3]，国内最早发生于云南元江西北灌渠，发病株率达75.4%[8]；随后在金沙江干热河谷地区爆发流行，病株率达30%～60%，有的甚至高达95%，危害日益严重[9]；2009年，周俊岸等[10]报道广西亚热带作物研究所芒果园发现芒果畸形病。近年，笔者在海南省东方市及三亚市的部分果园发现疑似芒果畸形病症状样品，病株嫩梢腋芽与顶芽丛生，节间明显变短，叶片变窄、变厚而脆，最后干枯。尚未见有对海南省芒果畸形病的报道。因此，作者对采集病样进行分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

典型芒果畸形病症状标本（图1），2013年11月采集自海南省东方市及2014年1月采集自海南省三亚市。参照文献[11]分离病原菌后备用。

1.2 方法

1.2.1 致病性测定 接种材料为健康盆栽2年生台农1号芒幼苗。采用活体接种，将分离纯化的菌株MMD-30在PD培养液[11]中振荡培养6 d后，过滤除菌体，配置约1×106个/mL分生孢子悬浮液。在健康芒果苗腋芽下约3 cm处用微型注射器注射0.1 mL悬浮液，对照接等量无菌水，每处理重复3次，敷湿润海绵保湿培养。观察记录发病情况，与自然发病症状做对比。待接种腋芽发病后对病斑再次进行组织分离、观察其病原形态。

1.2.2 病原菌形态学鉴定 将纯化后的病原菌接种到PDA培养基上，28 ℃黑暗培养5 d后，观察菌落颜色和形状，镜检分生孢子的形态、颜色，分别测量100个大分生孢子和小分生孢子大小。

1.2.3 病原菌的分子鉴定 参照OMEGA Fungal gDNA Kit说明书操作提取病原菌gDNA。参照鉴定芒果畸形病病原菌特异性引物对1-3F/R[4]（1-3F：5′-TGCAGATAATGAGGGTCTGC-3′和1-3R：5′-G

GAACATTGGGCAAAACTAC-3′）和Newman等[6]设计的AF1（AF1-F：5′-CTCCTCACAGGCGTTCGTAT

-3′和AF1-R：5′-AGATGCCTAGCCCCTTCAAC-3′）对分离病原菌进行分子鉴定。扩增体系：10×PCR Buffer（Mg2+ Plus）5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL，Taq 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 36.5 μL。扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。以Fusarium mangiferae菌株MMD-23为阳性菌株（该菌株分离自四川省攀枝花市仁和区的芒果畸形花，与以色列Stanley Freeman教授商酌鉴定，引物1-3F/R对该菌的PCR扩增产物为589 bp）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离与DNA提取

从具有典型症状的芒果腋芽分离获得9株镰刀菌，其中东方市5株（MMD-28～32）、三亚市4株（MMD-46～49），单孢纯化后保存于PDA斜面，10 ℃低温贮存、备用。

电泳检测显示，所提取的基因组总DNA片段较大，条带清晰，无杂带，-20 ℃保存备用。

2.2 致病性测定

按照柯赫氏法则，将分离得到的菌株回接到芒果苗腋芽下，注射浓度1×106个/mL的分生孢子悬浮液0.1 mL后，出现典型芒果畸形病症状（图2-A），即腋芽膨大并产生大量嫩芽，围绕主枝条长一圈嫩芽，嫩芽数明显多于空白对照，主枝条失去顶端优势，节间明显变短。空白对照无任何畸形症状（图2-B）。从接种发病部位再次分离、培养得到相同形态的病原菌，证明接种菌株为致病菌，符合柯赫氏法则。

2.3 病原菌形态学鉴定

在PDA培养基上，28 ℃光暗交替培养5 d菌落直径达3.25 cm，气生菌丝棉絮状，白色至浅粉红色，菌落边缘略不整齐，基部无色素沉着（图3-A）；产孢细胞着生于瓶状小梗上，单瓶梗或复瓶梗（图3-B），较短；瓶状小梗细小，近圆柱形。PDA培养基上产生少数大型分生孢子（图3-C），瘦长，镰刀状，两端略弯曲；顶端细胞尖端弯曲呈鸟喙状，足胞不明显；具3～5个隔膜，大小为（17～24）μm×（1～3）μm。PDA培养基上小型分生孢子（图3-C）数量较多，形状多样，多为卵圆形、肾形、纺锤形等；多假头状着生；隔膜数0～2个，大小为（3～11）μm×（0.5～3）μm。培养过程未见厚垣孢子，未见有性态和菌核产生。从形态上初步鉴定为Fuasrium mangiferae。

2.4 病原菌的分子鉴定

对引物1-3F/R的DNA扩增产物进行电泳检测显示（图4），分离得到的9株镰刀菌中，6株（MMD-30、MMD-32、MMD-46～MMD49）扩增得到了单一的589 bp条带，与阳性对照菌株MMD-23条带大小无差异，而阴性对照则无任何条带，表明这6株镰刀菌扩增结果为阳性。引物AF1的扩增反应呈阳性的菌株与引物1-3F/R相同（图4），扩增产物大小为200 bp。该结果表明这两对引物的扩增结果相一致。

3 讨论与结论

芒果畸形病的病原一直是国内外关注的热点[12]。目前，普遍认为Fusarium sp.为该病病原菌[13]。1999年，Freeman等[14]将GUS报告基因转入F. subglutinans，发现转化子能引起典型的畸形病症状，且发病组织中的侵染菌丝具有GUS活性，从而证明了F. subglutinans为芒果畸形病的病原菌。同样，2010年，吕延超[15]将GFP（绿色荧光蛋白）转入F. proliferatum，在芒果植株上注射接种分生孢子6个月后，发现转化子能引起典型的畸形病症状，且发病组织中能检测到绿色荧光，从而证明F. proliferatum为芒果畸形病的致病菌。詹儒林研究团队通过致病性测定和分子鉴定，先后报道F. proliferatum[16]和F. mangiferae[9]为中国芒果畸形病的致病菌。Otero-Colina等通过RAPD-PCR、ap-PCR和致病性测定发现，墨西哥芒果畸形病的病原菌为F. pseudocircinatum、F. mangiferae、F. proliferatum、F. sterilihyphosum和F. mexicanum，其中F. mexicanum为新发现的致病菌[17]。

镰刀菌的形态变异大，且不同种的镰刀菌形态差异不明显，如，F. proliferatum 与F. verticillioides 在形态上很相似，二者的区别主要在于产孢细胞不同，且F. proliferatum的分生孢子链也较F. verticillioides短[18]。因此，即使对于非常专业的镰刀菌分类学者来讲，也需要借助传统的形态学、生物学和分子生物学相结合的方法来准确区分镰刀菌属下各个种[19]。目前，利用单拷贝基因设计种特异性引物，用以快速鉴定镰刀菌属中相关种的方法也已经得到了广泛应用[5， 20]。Zhang和Ploetz[4]，Newman等[6]先后采用不同的分子标记，先后获得了F. mangiferae特异性鉴别引物，用于芒果畸形病病原菌的快速鉴定。但是，Zhang和Ploetz[4]所设计的特异性引物对镰刀菌的扩增过程中，存在一定的非特异性扩增现象，将其设计的1-3F/R引物和Newman等[6]设计的AF1引物相结合，能够更为准确地进行病原菌的鉴定，从而加快了该病菌的鉴别速度与准确度。

本文运用形态学鉴定、柯赫氏法则和分子鉴定技术首次鉴定了海南省东方市和三亚市的芒果畸形病的病原菌，供试菌株的形态与Crespo[5]等描述的F. mangiferae几乎一致，且与李瑟组组内F. mangiferae 特征最为接近。同时，采用参照Zhang和Ploetz[4]，Newman等[6]设计的F. mangiferae特异性引物，鉴定结果与预期一致。供试菌株的传统方法和分子鉴定技术结果一致，因此，确定海南省东方市、三亚市的芒果畸形病的致病菌为F. mangiferae。海南省芒果畸形病病原菌的鉴定，为深入研究该病害的传播途径、流行规律、防治措施、病害检疫奠定了重要基础。

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