高脂饮食致大鼠脂肪肝实验模型的建立

张伟 巴图得力根 韩志强 娜日苏

【摘 要】 目的：探讨脂肪肝动物模型的制作方法。方法：高脂乳剂灌胃复制脂肪肝模型，将大鼠随机分为生理盐水灌胃组和高脂乳剂灌胃组，分别于高脂乳剂灌胃14d、28d和3d时检测血脂4项和肝功能，并采用肝脏病理切片分析肝脏脂变情况。结果：在高脂乳剂灌胃14d后，大鼠出现高血脂症状并伴有轻度脂肪肝，随后出现血脂水平稳定上升，肝系数增大；28d时出现中度脂肪肝；3d时出现重度脂肪肝。结论：经过高脂饲料灌胃，3d内即可形成不同脂变程度的大鼠脂肪肝模型，而且造模时间短、价格低廉，是一种较好的脂肪肝模型制作方法。

【关键词】 大鼠；脂肪肝；动物模型

【中图分类号】R96.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-817（201）1-0019-03

随着人们膳食结构的改变，加上缺乏运动等原因，脂肪肝的发病率逐渐增高。目前，西方发达国家中的脂肪肝发病率为10%～24%，而我国脂肪肝发病率也成为病毒性肝炎之后的第二大肝病，上海和广州两地，脂肪肝的发病率就高达20%。如果不及时治疗，将会进一步恶化，导致肝纤维化甚至肝硬化，严重影响人们的身体健康，给家庭和社会带来很大的负担。本实验旨在探讨脂肪肝模型的复制方法，为进一步研究脂肪肝发病机理提供一种较好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 高脂饲料配方 胆固醇（批号：F20030410）、脱氧胆酸钠（批号：F20030410）、吐温80（批号：F20030410）、1-2丙二醇（批号：F20030410）均为分析纯，够自西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；丙赛优（批号：0300，上海朝晖药业有限公司）；猪油自制。

1.1.2 脂肪乳的配制[1] 按12.%吐温80、10%1-2丙二醇、0.%丙基硫氧嘧啶、1%猪油、1%脱氧胆酸钠、%胆固醇的比例配制。先将猪油30g放在200ml的烧杯中，放在磁力搅拌器上加热至40℃水浴中融化，加入10g胆固醇、1g研细的丙基硫氧嘧啶，充分搅匀，加入适量吐温不断搅拌直至乳化现象产生，制成油相。另一烧瓶中加入30ml蒸馏水和1-2丙二醇20ml，加热至60℃，然后加入胆盐2g溶解，制成水相。将两个烧杯液体充分混匀即可成为稳定的脂肪乳剂，使用时37℃水浴融。

1.1.3 普通饲料 玉米面3.4%，白面29.%，麸皮12.%，豆粉12%，鱼粉8%，酵母粉2%。

1.1.4 试剂盒 G、C测定试剂盒（北京福瑞生物工程公司）；AS、AL考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1. 2 方法 雄性清洁级 Wistar 大鼠28只（SCXK吉-20110-0004），体重（ 200±10）g。随机抽取8只作为对照组，用生理盐水灌胃每日1次，3 d后腹腔静脉抽血行血脂四项及肝功能检测、肝重测定以及肝脏病理检查。其余20只大鼠作为高脂乳剂组行脂肪肝模型复制，用高脂乳剂灌胃每日1次，饲养后的第14、28d各取只大鼠处死，第3d另取10只大鼠和对照组8只大鼠一同处死，腹腔静脉抽血行血脂四项及生化检测、肝重测定以及肝脏病理检查，观察肝脏脂肪变性程度。实验前动物禁食12h，用10%的水合氯醛以0.3ml/l00g[2]体重经腹腔内注射麻醉后开腹，腹下腔静脉采血，取3ml全血室温静置1min，3000r/min离心30min分离血清，备测血脂四项、肝功。各组大鼠于肝右叶取300mg肝组织标本，冰水中制成10%的匀浆，4℃4000r/min离心10min，提取上清液，用酶法测定G、C含量。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 检测指标 AS、AL、C、G、LDL、DL含量；肝匀浆G、C的含量；检测肝组织病理。

1.3.2 检测方法 ①肝功能及血脂四项指标AS、AL、C、G、LDL、DL采用全自动生化分析仪检测。②肝匀浆G和C用全自动生化分析仪检测。③组织病理观察：病理诊断是判断脂肪肝程度的金标准。取材后经10%福尔马林固定3h后，梯度酒精逐级脱水，石蜡包埋，冷冻，切片厚μm，E染色观察肝脏细胞脂肪变程度和范围。依据脂肪肝评分标准进行评分。

1.4 疗效判定标准 组织学疗效评估参照Brunt 等[3]制订的脂肪变分级标准，即0级：肝细胞脂变细胞占0～%；I级：肝细胞脂肪变细胞占%～33%；II级：肝细胞肪变细胞占33%～66%；III级：肝细胞脂肪变细胞占66%以上。采用生化指标AS、AL、C、G、LDL、DL，肝匀浆G和C，来判定肝功能和血脂的疗效。

1. 统计分析 利用SPSS 13.0 统计软件包对数据进行整理分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.0表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物情况 高脂乳剂灌胃饲养10d后大鼠皮毛蓬乱而无光泽，精神萎靡，食欲不振，体重减轻。生理盐水组大鼠体重呈增加趋势。

2.2 大鼠体重、肝重、肝指数 与生理盐水组相比，高脂乳剂组肝指数（肝湿重/体重×100%）在第4周末明显升高（P<0.0），第周末这种差异性仍然存在。高脂乳剂组大鼠体重明显小于生理盐水组，肝重相对于高脂乳剂组呈上升趋势，但无统计学意义（P>0.0）。见表1.

2.3 血脂水平情况 高脂乳剂组血清中C、G、LDL-C含量从第2周末就有明显上升（P<0.0），而DL-C则明显降低（P<0.0）。且该趋势在第4、周末仍然存在差异性。见表2、表3.

2. [JP3]肝内脂质变化 高脂乳剂组肝匀浆G、肝匀浆C从第2周末就有明显上升（P<0.0），且该趋势在第4、第周末仍然存在差异性。其中以肝匀浆C变化更为显著。见表。

2.6 肝脏组织学改变 高脂乳剂组大体见肝表面有油腻感，锇酸染色光镜下第14d肝细胞内有少量脂滴，第28d约1/ 3肝细胞含有细颗粒状脂滴，第3d约2/ 3以上肝细胞内出现脂滴，肝窦被挤压变窄，肝细胞形态不规则 。生理盐水组肝脏则未见以上改变。见图1。

3 讨论

脂肪肝是多种病因引起的肝脏脂肪变性，流行病学调查显示，酒精和肥胖是引起慢性脂肪肝的主要原因。20世纪80年代末期日美学者利用B超检查发现，正常人群脂肪肝发病率约为的10%，而肥胖患者的发病率为0%，嗜酒者的发病率为7.7%。脂肪肝的发病机理至今尚未明确，但通常认为脂肪肝的形成与脂肪代谢障碍有关，是肝细胞脂肪合成增加和氧化减少所致，肝细胞中的甘油三酯、极低密度脂蛋白合成和排出不平衡是形成脂肪肝的原因。目前，高脂血症动物造模方法各异，但主要有先天性、转基因和化学物质诱导的三种实验性动物模型[4]。前两种由于来源困难和代价昂贵，且与人类脂肪肝的形成特点不符合，限制了其应用，导致高脂饲料喂养或灌胃形成的实验动物模型在国内应用最为广泛。但高脂血症动物模型与其他疾病动物造模比较，存在周期过长、[JP2]费用过高或模型组血脂水平参差不齐等缺点。张东等通过实验结果证明，在猪油

和胆固醇的基础上加入丙基硫氧嘧啶，在10d、20d、30d时CO和LDL均升高、且DL显著降低，但G未见变化；在猪油和胆固醇的基础上同时加入胆盐和丙基硫氧嘧啶，各项指标在不同时期差异均有显著性，说明本配方可以造成理想的高脂血症模型，且造模所需时间最短，10d即可，稳定性较高，随时间延长，血脂水平也不断升高。倪鸿昌等[6]又在以上配方基础上提出用高脂饲料改良方诱导的脂肪肝动物模型，因其病理特征与人类相似，4周成为稳定脂肪肝模型，且价格低廉，方法简单而被广泛使用。本实验在倪鸿昌等高脂配方基础上又加以改动，用高脂饲料乳剂每日灌胃诱导大鼠脂肪肝，锇酸染色显示，第14d出现较多的脂滴积累；第28d超过2/3以上的细胞内均出现脂滴，并随时间延长小泡状脂滴有相互融合的趋势；第3d由于肝细胞内充满脂肪空泡，将核推向一边，肝细胞形态不规则，肝窦变窄，不规则。体重小于正常大鼠，肝重大于正常大鼠，可能由于高脂饲料胆固醇高，妨碍鼠的生长发育，致呈现皮毛蓬乱而无光泽，精神萎靡，食欲不振。

参考文献

[1] 倪鸿昌，李俊，金涌，等.大鼠实验性高脂血症和高脂血症性脂肪肝模型研究[J].中国药理学通报，2004，20（6）：703-706.

[2]曾民德.脂肪肝[J].中华消化杂志，1999，19 （2） ： 120-122.

[3] Brunt EM，JarmeyC G，Di Bisceglie AM，et al.Nonalcoholics teatohepatitis：a Proposal for grading and staging the histological lesions[J].Am J Gastroenterol，1999；94：2467-2474.

[4].Matteoni CA，Younossi ZM，Gramlieh ，et al.Nonalcoholic fattyliverdisease：aspectrum of clinical andpathological sevedty[J].Gastroenterology，1999，116：1413-1419.

张东，武海军，陈士萍，等.人鼠实验性高脂血症五种造模方法的比较[J].中国药理学通报，2007，23（9）：124-126.

[6]. 刘嵩，卢笑丛，葛建，等.高脂所致脂肪肝动物模型建立的动态研究[J].中国药理学通报，2006，22（11）：1399-403.

（收稿日期：201.04.23）