生物发酵床养猪垫料中营养成分和微生物群落研究

赵国华　方雅恒　陈贵

摘要 [目的] 探讨发酵床养猪模式下不同使用年限微生物群落的变化以及不同使用时间、不同深度的发酵床垫料中垫料组分的变化。[方法] 采用常规分析方法测定样品中的营养成分含量，对不同年限样品中微生物分离提纯后，结合16S rRNA分子生物学鉴定对其微生物群落进行分析。[结果] 随着发酵床使用时间的延长，垫料中的总氮、总磷、钾、钙、粗灰分和粗蛋白含量均显著增加，而水分含量降低不明显；使用1年和2年的垫料从上层到下层总氮、总磷、总钾和钙的浓度逐渐降低，不同使用时间、不同深度发酵床垫料中粪尿组水分、总氮、总磷、钾、钙、粗灰分、粗蛋白均高于其他组。随着使用年限的增加，猪生物发酵床垫料中微生物群落的多样性有降低的趋势。芽孢杆菌属细菌和梭菌属细菌在1年期样品和2年期样品中都是优势菌，对猪生物发酵床垫料中有机质的降解发挥着重要的作用。[结论]该研究可为垫料的资源化合理利用提供理论依据。

关键词：发酵床；微生物；多样性；成分

中图分类号：S188+.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-098-02

规模化的养殖推动了我国农业经济的发展，但是随之带来的环境污染问题也越来越引起人们的重视。发酵床养殖作为新型养殖技术，自从引入我国后被大力地推广和使用，为解决畜牧环境污染问题带来了新途径。发酵床养猪技术是基于控制畜禽粪便排放与污染的一种新型环保型养殖技术，将锯末、稻壳、秸秆等材料接种土著微生物菌种，堆积发酵后用作垫料，在经过改造的猪舍内加入上述有机垫料制成发酵床。在发酵床上养猪，粪尿会被垫料吸附，微生物降解其中的有毒有害物质，同时利用产生的生物热杀灭粪便中的肠道寄生虫卵，从而达到降低养殖舍内有害气体浓度、减少养殖污染排放以及提高猪的生长性能的目的[1-3]。发酵床养殖技术的核心是垫料中微生物群落的活动。笔者通过监测嘉兴某发酵床养猪场生长肥育猪舍使用1年2年的不同深度发酵床垫料中营养物质成分（水、粗蛋白、粗灰分、钙）的变化以及氮、磷、钾含量的变化，探索垫料中这些元素的累积情况及动态变化规律，并通过对猪生物发酵床样品进行基因组DNA提取、16S rRNA扩增、测序分析等，了解猪生物发酵床微生物的动态变化规律，以期为垫料的资源化合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 发酵床样品均来由金鸿牧业有限公司提供。第1年和第2年的发酵床，采用对角线采样法分别采集5个点的样品（其中包含粪尿区）[3]，每个点分别从上至下用刀取0～15 cm（上层）、30～40 cm（中层）和60～70 cm（下层）的垫料样品，同一深度各2.0 kg样品混合，然后再采用四分法取500 g，备用。粪尿点各层单独取样各2.0 kg，单独混匀。混合方法：将取得的每层垫料样品混在一起，用四分法选取500 g，置于自封袋中密封，防止水分挥发，置于有冰袋的保温盒中，贴上标签迅速带回实验室备用。

1.2 垫料的测定指标及方法 水分含量测定：采集回的垫料用四分法选取500 g，先将垫料置于65 ℃烘箱烘至恒温，用饲料粉碎机粉碎后通过40目筛，混匀样品，装入广口瓶中贴上标签保存，待进行其他各项指标测定。垫料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的测定方法参考《土壤农业化学分析方法》[4]。全氮和全磷含量分别采用半微量凯氏定氮法和钼黄显色光度法测定；全钾含量采用原子吸收分光光度法测定。

1.3 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠50.0 g、琼脂20 g，蒸馏水溶解定容至1 L，调节pH至7.6，于121 ℃下高压灭菌30 min。

1.4 微生物的分离、纯化及保存 试验中分别用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基从稀释的猪生物发酵床样品中选择性地分离细菌和放线菌，以供细菌16S rDNA分子生物学鉴定。

1.5 细菌16SrDNA片段的扩增 以细菌通用引物 27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TACGGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′为引物，猪生物发酵床分离培养的细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR 扩增反应体系（50 μl）：25 μl 2×MightyAmp Buffer Ver.2（含Mg2+、dNTP plus），正反向引物各15 pmol，基因组DNA（直接挑菌作为基因组DNA模板），MightyAmp DNA Polymerase 1 μl。

PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min， 30个循环；最后68 ℃延伸10 min。

PCR反应结束后，取PCR产物5 μl和2 μl上样缓冲液混匀后点样于浓度1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，于90 V电压下电泳30 min。电泳结束后，立即在琼脂糖凝胶成像系统下观察，拍照并存盘。

1.6 细菌RFLP酶切分型分析 克隆后，对阳性克隆子进行PCR扩增，然后使用限制性内切酶对扩增产物酶切，酶切DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，所得DNA带型图谱通过凝胶分析软件进行比对，然后选取不同的操作单元，并将对应的阳性克隆子送交测序公司测序。

1.7 Blast比对 将测序结果在核酸数据库（GenBank）中进行Blast。

2 结果与分析

2.1 不同深度发酵垫料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的变化 由表1可知，2年间不同深度发酵床垫料中，粪尿组水分含量均显著高于其他组。使用第1年和第2年的发酵床垫料水分含量变化差异不显著，这可能与发酵床垫料管理得好及定期深翻垫料有关。随着垫料深度的增加，水分含量逐渐降低。垫料中的粗灰分主要来源于垫料组分及猪不断排泄的粪污。该试验结果表明，随着垫料深度的增加，垫料粗灰分含量逐渐下降，这主要是由于猪的粪尿主要集中在表层的缘故。对比第1年和第2年的数据发现，垫料中粗灰分的浓度逐渐升高，表明粗灰分有累积作用。粪尿组各层显著高于其他组。随着垫料深度的增加，垫料中粗蛋白的浓度逐渐降低，这是由于粪尿中含有一定量的含氮化合物，因而垫料表层粗蛋白含量最高。随着垫料使用时间的延长，垫料中粗蛋白的浓度逐渐升高，表明粗蛋白具有累积作用。粪尿组显著高于其他组。

2.2 2年间不同深度发酵床垫料中总氮、总磷、总钾和钙含量 发酵床垫料中的总氮、总磷、总钾和钙含量主要来源于2个方面：一方面是垫料中的锯末、秸秆和稻壳，另一方面是猪粪污。饲料中的营养成分被猪消化吸收后，排泄物主要是以粪污的形式不间断排泄。由表2可知，垫料中总氮、总磷、总钾和钙的浓度随垫料使用时间的延长逐渐升高。随着垫料深度的增加，垫料中总氮、总磷、总钾和钙的浓度逐渐降低。粪尿组上、中、下层总氮、总磷、总钾、钙的浓度均明显高于其他组上、中、下层。这表明猪的习性是群居，这不利于充分利用发酵床的功能特性。该试验结果与其他研究结果一致[5-7]。

2.3 微生物总基因组DNA 将所采集到的样品经过前处理后，提取微生物总基因组DNA并进行纯化，再进行琼脂糖凝胶电泳检测。从图1可以看出，微生物总基因组DNA完整、无拖尾和杂带，能满足后续试验要求。

2.4 保育期不同年限样品的16SrDNA序列比对结果 将保育1年、保育2年的样品分别与GeneBank 进行Blastn序列比对，发现保育期1年的样品微生物（相似度达99%）主要有：芽胞杆菌属（Bacillus sp）、产碱杆菌属（Alcaligenes sp.）、破伤风杆属（Clostridium sp.），藤黄单胞菌属（Luteimonas sp.）、外硫红螺菌属（Ectothiorhodospria sp.）、海杆菌属（Marinobacter sp.），假单胞菌属（Pseudomonas sp）和索氏菌属（Thauera sp）等。保育期2年的样品中微生物（相似度达99%）主要有：芽胞杆菌属（Bacillus sp.）、破伤风杆属（Clostridium sp.）、Uncultured bacterium，细杆菌属（Microbacterium sp）、节细菌属（Arthrobacter sp）、链霉菌属（Streptomyces sp）、芽胞八叠球菌属（Sporosarcina sp.）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）等。生物发酵床保育1年样品中与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）相关的克隆子数有36个，占所有克隆子数的28.57%；与破伤风杆属（Clostridium sp.）相关的克隆子有32，占所有克隆子的35.40%，因此样品中芽孢杆菌属和破伤风杆属占优势。生物发酵床保育2年期样品中克隆子较多的序列归属于芽孢杆菌属和破伤风杆属有克隆子27个和23个，分别占21.60%和18.40%，在样品中占有优势，为优势菌。

芽孢杆菌属（Bacillus）和梭菌属（Clostridium）在生物发酵床保育期样品中发挥着重要的作用，与其他研究结果相一致[8-9]。另外，有几个序列与已知的细菌序列没有任何的相似性，它们在生物发酵床中的作用还需要进一步研究。

3 小结

（1）不同使用时间、不同深度发酵床垫料中，粪尿组水

分、粗灰分、粗蛋白、总氮、总磷、总钾和钙含量均显著高于其他组。

（2）从猪生物发酵床样品中分离到的16SrDNA序列可以看出，随着发酵床使用年限的增加，发酵床内的微生物群落也在不断地更替演变，保育2年时微生物群落的减少，说明随着使用年限的增加，猪生物发酵床垫料内的微生物群落的多样性有降低的趋势。在保育期样品中，芽孢杆菌属和梭菌属始终是独立的的分支，对发酵床物质代谢和能量代谢发挥着巨大的作用。

参考文献

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