辣椒素对人大细胞肺癌NCI—H460细胞侵袭能力及E—钙黏蛋白、Snail蛋白表达的影响

任公平等

摘要：目的 观察辣椒素对人大细胞肺癌NCI-H460细胞侵袭能力及E-钙黏蛋白（E-cadherin）和Snail蛋白表达的影响，探讨其抗非小细胞肺癌的可能机制。方法 体外培养NCI-H460细胞，以不同终浓度辣椒素进行处理，未加辣椒素为对照组。采用Hoechst33342核染色分析、Transwell小室细胞侵袭实验及Western blot检测，观察辣椒素对NCI-H460细胞凋亡、侵袭能力及E-cadherin、Snail蛋白表达变化的影响。结果 与对照组比较，Hoechst33342核染色分析表明，辣椒素各浓度组可明显诱导NCI-H460细胞凋亡（P<0.05）；Transwell体外侵袭实验结果显示，辣椒素可显著抑制侵袭穿膜细胞数（P<0.05）；Western blot检测结果表明，辣椒素各浓度组E-cadherin表达水平明显升高、Snail表达水平明显降低（P<0.05）。结论 辣椒素能明显诱导NCI-H460细胞凋亡；降低Snail表达、刺激E-cadherin的表达从而抑制NCI-H460细胞侵袭能力，可能是其抗非小细胞肺癌的机制之一。

关键词：辣椒素；非小细胞肺癌；侵袭；E-钙黏蛋白；Snail蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0055-04

Effects of Capsaicin on the Invasion Ability of Human Large Cell Carcinoma NCI-H460 and Expressions of E-cadherin and Snail REN Gong-ping1， LV Zheng-xin2， LIU Hong-yang3， LIANG Guo-ying4 （1.Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China；2.Jiamusi Hospital of TCM， Jiamusi 154002， China；3.Qiqihaer Hospital of TCM， Qiqihaer 161000， China；4.The First Affiliated Hospital to Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of capsaicin on the invasion ability of human large cell carcinoma NCI-H460 and the expressions of E-cadherin and Snail；To discuss the possible mechanisms of anti-non-small cell lung cancer. Methods NCI-H460 cells were cultured in vitro and treated with capsaicin at various concentrations， and no capsacin-treated group was set as control group. Effects of capsaicin on NCI-H460 apoptosis， its invasion ability， and the changes in protein expressions of E-cadherin and Snail were evaluated by Hoechst33342 nuclear staining assay， Transwell chamber invasion assay， and Western blot respectively. Results Compared with the control group， Hoechst33342 nuclear staining assay showed that capsaicin could induce NCI-H460 cell apoptosis （P<0.05）；Transwell invasion in vitro results showed that capsaicin could significantly inhibit invasion of penetrating cells （P<0.05）；Western blot analysis showed that E-cadherin expression level was significantly elevated and snail expression level significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Capsaicin can induce NCI-H460 cell apoptosis. Decrease the Snail expression and stimulate E-cadherin expression so as to inhibit the invasion ability of NCI-H460， which may be one of its mechanisms of anti-non-small cell lung cancer.

Key words：capsaicin；non-small cell lung cancer；invasion；E-cadherin；Snail

通讯作者：梁国英，E-mail：lianggy1976@163.com

据预测，到2020年，中国将有550万新发肺癌病例，死亡人数将达400万[1]。在肺癌病理学分型中，80%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC），包括腺癌、鳞状上皮细胞癌和大细胞癌，其侵袭和转移能力是导致患者死亡及复发的主要原因，并使其成为当今世界上对人类健康和生命危害最大的恶性肿瘤之一[2]。近年来，关于辣椒素（capsaicin）抗癌作用的研究在国内外日益受到学者的高度重视。辣椒素是红辣椒中的一种活性成分。有研究表明，辣椒素可以抑制癌症细胞增殖、促进凋亡，因此，可作为一种药物或传统化疗药物的辅助用药[3-5]。虽然辣椒素具有抗癌症作用，但其有关NSCLC的研究鲜见报道。本实验研究辣椒素对NCI-H460细胞侵袭能力及E-钙黏蛋白（E-cadherin）、Snail蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制，以期为NSCLC治疗提供新思路，为临床用药提供实验基础。

1 实验材料

1.1 细胞

人大细胞肺癌NCI-H460细胞，购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物及配制

辣椒素（纯度>99%，美国Sigma公司），溶解于二甲基亚砜（DMSO），配成300 mmol/L溶液，-20 ℃保存。临用时以完全培养液稀释到所需浓度。

1.3 主要试剂与仪器

RPMI-1640培养基，美国HyClone公司；Hoechst33342、牛血清白蛋白（BSA）、DMSO，美国Sigma公司；Transwell小室，美国Corning公司；基质胶Matrigel，美国BD公司；E-cadherin、Snail、β-actin，上海浩然生物技术有限公司；E-cadherin鼠抗人单克隆抗体，美国ProMab公司；Snail兔抗人多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；HRP标记抗鼠IgG二抗及HRP标记抗兔IgG二抗，上海碧云天公司。二氧化碳培养箱（MCO-20AIC），日本SANYO；荧光显微镜（BX53），日本OLYMPUS；电泳仪（DYCZ-20B），北京六一仪器厂；凝胶成像系统（ChemiDox XRS），美国Bio-RAD科技。

2 实验方法

2.1 细胞培养

NCI-H460细胞保存在含有10%BSA的RPMI-1640营养培养基，37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养。当NCI-H460细胞达80%汇合度时，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。按照细胞密度2×106个细胞/孔接种于超低吸附6孔板中，37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养48 h。收集悬浮的细胞，经EDTA处理制备成单细胞悬液，然后用RPMI-1640培养液洗涤细胞。收集对数生长期细胞，备用。

2.2 Hoechst33342核染色分析

取对数生长期NI-H460细胞，按照细胞密度1×104个/孔接种于96孔板中，37 ℃、5%CO2及饱和湿度下过夜培养。次日，实验组每孔加入终浓度为100、200、300 ?mol/L的辣椒素，对照组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。每组设6个平行孔。37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h后，加入30 ?g/mL Hoechst33342 37 ℃，孵育30 min。荧光显微镜观察细胞凋亡情况。随机选择不同视野计数200个细胞，并分别计算凋亡细胞核数与正常细胞核数。实验重复3次。计算凋亡率[凋亡细胞核数÷（正常细胞核数+凋亡细胞核数）×100%]。

2.3 Transwell小室体外侵袭实验

参照文献[6]方法，Transwell小室用前铺上50 ?L 0.5%Matrigel膜基质37 ℃孵育过夜。取对数生长期NCI-H460细胞，将实验组细胞用终浓度为100、200、300 ?mol/L的辣椒素在37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h，对照组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。按照细胞密度5×104个细胞/接种于Transwell小室内室，并在Transwell小室下室加入含有10%BSA的完全培养液。孵育24 h后，取出Transwell小室，去除未穿膜细胞。甲醇固定15 min，以10 mg/mL Hoechst33342染色30 min。荧光显微镜计数穿过微孔膜的细胞数。每组细胞随机计数10个视野，取其平均值。实验重复3次。

2.4 Western blot检测

取对数生长期NCI-H460细胞，将实验组细胞用终浓度为100、200、300 ?mol/L的辣椒素，37 ℃、5%CO2及饱和湿度下培养24 h，对照组除未加辣椒素外，其余条件与实验组完全一致。用细胞裂解液（20 mmol/L Tris-HCl，1.5%Triton X-100，150 mmol/L NaCl，10%甘油，1 mmol/L Na4P2O7，50 mmol/L NaF，1 mmol/L PMSF）和蛋白酶抑制剂（5 ?mol/L AEBSF-HCl，5 ?mol/L EDTA，10 mmol/L leupeptin，1.5 mmol/L E-64，pH 7.4）裂解细胞后，收集裂解液，Bradford法测定蛋白质含量。取20 ?g蛋白质，加入等体积2×上样缓冲液，95 ℃变性5 min。随后进行7.5%SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后，电转至0.45 ?m硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的PBST（25 mmol/L Tris pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween20）封闭1 h，分别加入E-cadherin、 Snail抗体（1∶1000稀释），4 ℃孵育过夜，PBST洗涤3次，每次5 min。加入HRP标记的二抗（1∶2000稀释）室温孵育2 h，PBST洗涤3次，每次5 min。按同法与β-actin抗体孵育。ECL化学发光试剂显色，通过Bio-Rad凝胶成像进行目的条带的表达检测及分析。蛋白相对表达强度=目标蛋白表达强度/β-actin蛋白表达强度。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。正态计量数据用—x±s表示，正态资料组间比较采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 辣椒素对NCI-H460细胞凋亡的影响

Hoechst33342染色结果显示，辣椒素终浓度为300 ?mol/L时可见凋亡细胞碎片或者核固缩呈致密浓染、凋亡小体等凋亡典型特征性改变，细胞凋亡率为39.4%，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。辣椒素终浓度为100、200 ?mol/L时未见细胞凋亡和坏死，细胞核形态正常，染色质均匀，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图1、表1。

4.2 辣椒素对NCI-H460细胞体外侵袭能力的影响

Transwell小室体外侵袭实验结果显示，与对照组比较，辣椒素终浓度为200、300 ?mol/L时，NCI-H460细胞的侵袭穿膜细胞数均显著下降（P<0.05），并呈浓度依赖性；辣椒素终浓度为100 ?mol/L时， NCI-H460细胞的侵袭穿膜细胞数虽然减少，但与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图2、表2。

4.3 辣椒素对NCI-H460细胞E-钙黏蛋白、Snail蛋白表达的影响

辣椒素终浓度为200、300 ?mol/L时，与对照组比较，E-cadherin表达水平显著升高，Snail表达水平显著降低（P<0.05），并呈浓度依赖性；辣椒素终浓度为100 ?mol/L时，与对照组比较，E-cadherin和Snail表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结果见图3。

5 讨论

辣椒素作为食物和传统药物已有几千年的历史，于1999年载入《美国药典》[7]。辣椒素可通过多种途径在体内外发挥抗癌症作用，有研究表明，辣椒素可抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长[8]，辣椒素可诱导人黑色素瘤A375-S2细胞的凋亡[9]。然而，辣椒素对NSCLC是否具有抑制作用目前尚未明了。因此，本研究前期实验以不同终浓度辣椒素作用于NCI-H460细胞，观察辣椒素抗NSCLC效应。结果发现，辣椒素对NCI-H460细胞活率有一定抑制作用，提示辣椒素具有潜在的抗NSCLC效应。

癌症的侵袭和转移是导致癌症患者死亡的主要原因。NSCLC转移复发率更是居于原发性恶性肿瘤的前列[10]。因此，探讨肺癌在分子水平的侵袭转移机制尤为必要。增殖失控和恶性侵袭是癌症细胞的两大特征[11]。癌症细胞的侵袭是一个复杂的过程，包括癌症细胞与基质的黏附、基质成分的蛋白水解、癌症细胞通过基质的缺损发生迁移3个步骤[12]。

上皮-间质转变（epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT）是促进癌症细胞的原位侵袭和远处转移的一个关键因素，得到学者的广泛认可和关注。EMT改变细胞的行为，但大多数情况下，提高癌症转移的能力，包括增强原发癌症细胞的迁移及抑制癌症细胞凋亡。EMT最重要的标志性变化是上皮细胞E-cadherin减少或丢失。E-cadherin是一种依赖Ca2+细胞间跨膜粘连糖蛋白分子，主要存在于上皮组织中，参与细胞间的连接，具有抑制癌症侵袭转移的作用。E-cadherin表达下调或抑制和功能丧失都可以启动EMT，癌症细胞经过这种细胞表型的转化获得更高的侵袭性[13-14]。在对E-cadherin表达调控的研究中发现，Snail是EMT中的主要调节蛋白，是含有锌指结构的DNA结合蛋白。Snail能够通过转录调节抑制E-cadherin基因的表达，引起上皮细胞向间质细胞表型的转变，诱导EMT的发生[15]。本研究中，以辣椒素处理NCI-H460细胞，Transwell小室体外侵袭实验结果显示，辣椒素可显著抑制侵袭穿膜细胞数，表明辣椒素可抑制癌症细胞的侵袭。进一步通过Western blot检测，结果显示，辣椒素可减少NCI-H460细胞Snail表达，刺激E-cadherin的表达，逆转EMT，揭示辣椒素可能通过抑制Snail表达、增加E-cadherin的表达来抑制癌细胞的远处侵袭能力。同时Hoechst33342核染色分析还表明，辣椒素可诱导NCI-H460凋亡。

综上所述，辣椒素具有明显的NCI-H460细胞毒性作用，诱导其凋亡。而且辣椒素可通过降低Snail表达，刺激E-cadherin表达抑制NCI-H460细胞侵袭能力，可能是其抗NSCLC机制。

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（收稿日期：2015-03-13）

（修回日期：2015-03-28；编辑：华强）