钟植文,冼望强,黎先伟,何柳芬,刘 薇,杨傲冰*
(1.广东永顺生物制药股份有限公司,广州511356;2.广东省动物防疫物资储备中心,广州510520)
禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的感染和/或疾病综合征,分高致病性和低致病性两种,低致病性以H9亚型禽流感为主[1]。目前国内养鸡场多常用BJ94类,如F、SS、SD696等毒株的疫苗,起到一定的预防作用,但未能达到100%的完全保护,仍有 H9亚型禽流感发生[2-3]。2013年冬,广东珠三角地区某鸡场的肉鸡群发病并出现死亡,发病前4天死亡率共计超过1%。本试验从发病肉鸡群中采样,经病毒的分离、鉴定,确定为H9亚型禽流感病毒。对分离株的HA基因进行序列测定和分析,并与近年流行的H9亚型禽流感毒株和部分常用疫苗毒株HA基因、蛋白进行相似性比较和分析,旨在从分子水平上了解广东地区目前H9亚型禽流感病毒的毒力特点,为该病的预防和控制提供理论依据。
1.1.1 病料样本 于2013年采自广东珠三角地区某鸡场的发病肉鸡群。
1.1.2 试验动物 10日龄SPF鸡胚由广东永顺生物制药股份有限公司提供。
1.1.3 试剂 新城疫病毒、减蛋综合症病毒、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、H5、H7、H9标准阳性血清购自广东省动物防疫监督所;MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、M - MLV 反转录酶、RNasin、dNTP、Premix Ex Taq购自 TaKaRa(大连)公司。
1.2.1 病毒分离和传代 采集发病鸡的气管、肺脏等脏器,研磨后冻融3次,3000 r/min离心8 min,上清液经细菌滤器过滤除菌。滤液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚8只,0.2 mL/只,接种后置37℃温箱孵化,弃去24 h内死亡鸡胚,每天照胚三次,将死亡鸡胚置于4℃冰箱,至第96 h将全部鸡胚置于4℃冰箱。观察死亡鸡胚病变,收获死亡鸡胚和冻死鸡胚尿囊液,并作无菌检查,然后连续传代。
1.2.2 血凝试验和血凝抑制试验 参照文献[4-5]配制1%鸡红细胞悬液,取分离株鸡胚尿囊液进行微量血凝试验;然后具有血凝活性的鸡胚尿囊液分别与新城疫病毒、减蛋综合症病毒和禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的标准阳性血清进行微量血凝抑制试验。
1.3.1 引物设计 根据该毒株的初步实验结果,从GenBank上获取多株H9亚型AIV基因序列分析比较后,使用 DNAStar(Verison4.0)和 Primer Premier(Verison5.0)针对HA基因核苷酸序列的保守区域设计了1对特异性引物,用于扩增包含HA基因的核苷酸片段,所设计引物送上海英骏生物有限公司按照PAGE级别合成。引物序列如下,HA1:AGCAAAAGCAGGGG;HA2:AGTAGAAACAAGGGTGTT,预计扩增1700 bp。
1.3.2 RT-PCR 反应 用 Takara MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取分离株鸡胚尿囊液的病毒总RNA,用随机引物为反转录引物合成cDNA,再用针对H9亚型禽流感病毒HA基因所设计的特异性引物进行PCR扩增检测,将RT-PCR扩增产物电泳检测结果。
1.3.3 序列测定和分析 扩增产物经回收纯化后送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行序列测定,将测得的序列提交NCBI BLAST SERVER进行联机检索。应用DNAStar软件分析HA蛋白裂解位点的氨基酸序列、受体结合位点以及潜在的糖基化位点,并利用 MEGA 5软件绘制系统进化树。从GenBank上获得 BJ94、SS、F、SD696 等疫苗毒株以及近年来流行毒株的HA基因核苷酸序列(表1),结合本试验分离株的相应序列,利用DNAStar软件包中的MegAlign程序中Clustal W方法进行相似性比较。
2.1 病毒分离和传代 经处理的病料接种10日龄SPF鸡胚,96 h内均未出现死亡,收获冻死鸡胚尿囊液,无菌检查为阴性。
2.2 血凝试验和血凝抑制试验 分离株的鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞,表明其对鸡红细胞具有血凝性,血凝效价(HA)为1∶256。而新城疫病毒、减蛋综合症病毒和禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型的标准阳性血清对分离株的血凝抑制效价(HI)分别为 <1∶2、<1∶2、<1∶2、<1∶2、1∶256,证明分离到的病毒株为禽流感病毒H9亚型,命名为A/chicken/Guangdong/JL/2014(简称为JL)。
2.3 RT-PCR扩增结果 利用特异性引物对JL株的RNA进行RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得与预期大小一致的目的片段(图1)。
2.4 HA基因序列的测定及遗传进化分析 序列测定后,将JL株的HA基因序列经NCBI BLAST SERVER检索,结果显示其与GenBank上的RZ853株的核苷酸序列相似性最高,达到97%。利用DNAStar软件对JL株的HA基因序列进行分析,结果表明其HA基因含有一个长度为1683个核苷酸的完整ORF,预计编码560个氨基酸。推导的氨基酸序列分析表明,当中含有8个潜在的糖基化位点,依 次 为:29NST、141NVS、145NGT、298NTT、305NVS、313NCS、492NGT、551NGS。受体结合位点的氨基酸分别为:109Y、161W、163T、191N、198T、202L、203L,即除了198位氨基酸有所变化外,其它位点均很保守;而其226位氨基酸为L,为哺乳动物受体结合位点的特征氨基酸。裂解位点(335~341位)的氨基酸序列为RSSR↓GLF,裂解位点附近均无连续碱性氨基酸插入,仅能被有限的细胞蛋白酶识别,符合低致病性禽流感病毒的分子特征[6-7](表2)。基于JL株与GenBank中的H9亚型禽流感毒株分群参考毒株、国内常用疫苗株以及近年来流行毒株的HA基因核苷酸序列,利用MEGA5.2软件绘制系统进化树(图2)。遗传进化分析结果表明,JL株属于4.2.5分支,与RZ853株的亲缘关系最近,与GX55、LG1等近年来流行毒株处于同一进化分支;而国内常用疫苗株F、SS、SD696与BJ94株同属4.2.3分支。分离的JL株所处的4.2.5分支和SS株等常用疫苗株所处的4.2.3分支同属4.2这一大分支,但两个分支之间有一定的遗传距离[8-9]。
图2 分离株的HA基因的系统进化树
表2 JL株与各参考毒株HA蛋白关键位点的比较
2.5 HA基因和蛋白序列相似性分析 利用DNAStar软件包中的MegAlign软件对JL株HA基因核苷酸、蛋白氨基酸序列与GenBank上获得毒株的相应序列进行相似性比较。结果表明,JL株HA基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列与RZ853株等国内近年流行的4.2.5分支H9亚型禽流感病毒的相似性较高,分别为90.9% ~97%和94.3% ~99.5%,而与国内常用疫苗株 F、SS、SD696 等 4.2.3 分支毒株的相似性较低,分别为88.4% ~89.6%和90.7% ~91.4%。由此可见,同属4.2 分支的 4.2.5分支(JL株等流行株为代表)和4.2.3分支(SS、F株等常用疫苗株为代表)之间存在了一定的差异。
3.1 JL株的分离鉴定 本试验从发病鸡群中分离到JL株,它对鸡红细胞有血凝性,而凝集可被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清所抑制,测序结果分析显示,JL株的HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为RSSR↓GLF,符合低致病性毒株的分子特征,证明JL株为H9亚型禽流感病毒低致病力毒株。
3.2 HA基因分析 裂解位点、受体结合位点和抗原位点都位于血凝素HA蛋白中,选用HA基因来分析H9亚型禽流感病毒的致病性、宿主特异性、抗原性以及遗传变异等情况,可得到较为可靠的分析结果。受体结合位点方面,JL株及近年来的流行株HA蛋白的第226位氨基酸均发生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突变,呈现出典型的人流感病毒受体结合特性,这提示H9亚型禽流感病毒不经中间宿主适应就能直接感染人类的趋势更明显,在未来可能对公共卫生安全构成巨大威胁[10]。至于潜在糖基化位点,JL株相比 F、SS等疫苗株发生了 S145N、T220I、P315S等突变,导致缺少 218NRT、增加了145NGT、313NGT潜在糖基化位点。145NGT的出现造成病毒不与抗H9N2的单克隆抗体F6、2A4发生反应,直接导致病毒致病性和抗原性的改变[11];但其它两个突变对于抗原性有多大影响,目前尚未清晰。基于JL株HA基因序列的系统进化树表明,JL株属于4.2.5分支,而国内常用疫苗株F株、SS株、SD696株与BJ94株同属4.2.3分支,JL株所处的4.2.5分支和疫苗株所处的4.2.3分支虽然同属4.2这一大分支,但两个分支之间有较明显的遗传距离和差异。本次分离的JL株和当前的流行株类似,均与疫苗株有一定的核苷酸、氨基酸序列以及抗原性差异,当前使用的疫苗株不一定能够提供100%的完全保护。
3.3 H9的防控 当前一些肉鸡场有H9亚型禽流感的暴发和流行,不能够完全归结为毒株变异、抗原性改变而使现有的疫苗不能完全保护,在多数情况下可能还与饲养环境、管理水平、免疫失误等原因有关。毕竟商品肉鸡生长周期短,免疫器官发育尚未成熟,接种灭活疫苗并未能迅速产生有效保护力,加上灭活疫苗主要诱导机体产生循环抗体,免疫鸡群可能缺乏足够的分泌型抗体,从而对粘膜的保护效果较低。如果饲养环境差,病原复杂,管理水平低,应激因素多,均会加重疫情。因此,要结合隔离、消毒等生物安全措施以及规范饲养管理来综合防治,并适当结合应用有效的优质灭活苗(含有4.2.5分支毒株)进行补免,这有可能减少H9亚型禽流感的发生,或者降低其危害。
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