肿瘤坏死因子-α对大鼠离体灌注肾血管收缩的影响

郭莲怡 金旭鹏 王桂君 李晓飞 牛 威 (辽宁医学院附属第一医院消化科，辽宁 锦州 200)

终末期肝硬化和重型肝炎常并发多脏器衰竭，尤其是肝肾综合征(HRS)时，患者预后极差。目前认为HRS的发生是肾血管收缩、肾脏低灌注所致，其机制尚不完全清楚。肿瘤坏死因子(TNF)-α作为重症肝炎发生的重要因子〔1〕，与重症感染时肾衰竭的发生发展明显相关〔2〕。本研究观察TNF-α对离体大鼠肾血管收缩的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择清洁级雄性SD大鼠56只，重约250～300 g。由辽宁医学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK(辽)2003-0007，开放系统饲养，实验前禁食12 h。

1.2 主要试剂和仪器 TNF-α、内皮素(ET)-1(Sigma公司)、Verapamil(上海德默生物科技有限公司)、2-氨基乙基二苯硼酸盐(2-APB，Sigma公司)、Kreb灌流液、无钙 Kreb灌流液。minipuls2灌注泵，法国Gilson;RM6000多导生理记录仪，日本;恒温灌注池，广东;Oxnard CA张力换能器，美国Gould;氧合器，热交换器、HTG恒温器，上海;倒置显微镜，德国Carl Zeiss公司。

1.3 离体灌注肾实验模型的建立〔3〕戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。剪毛，消毒，腹壁正中切开，分离肠系膜上动脉及右肾动脉。肠系膜上动脉插管至右肾动脉，三通接灌注装置和张力换能器，开放肾静脉。取出左肾称重作为对照肾重。灌注过程:启动灌注泵灌流，流量为5 ml/min，温度为37℃，并给予95%氧和5%二氧化碳。

1.4 实验分组 56只大鼠制备离体灌注肾模型后随机分为8组(n=7):①A1组:Kreb液灌流;②A2组:含TNF-α(100μg/L)的Kreb液灌流;③B1组:含Verapamil(0.1 mmol/L)的Kreb液灌流;④B2组:含 Verapamil(0.1 mmol/L)及 TNF-α(100 μg/L)的Kreb液灌流;⑤C1组:无钙Kreb液灌流;⑥C2组:含TNF-α(100μg/L)的无钙Kreb液灌流;⑦D1组:含2-APB(50μmol/L)的无钙Kreb液灌流;⑧D2组:含2-APB(50μmol/L)及 TNF-α(100μg/L)的无钙Kreb液灌流。

1.5 离体肾体外灌注过程 分三期:平衡期:各组在灌流通路上，均先用有钙或无钙Kreb液灌流30 min达平衡;灌流期:用含特定成分的有钙或无钙Kreb液灌流90 min;刺激期:各组均予含ET(1 nmol/L)的有钙或无钙Kreb液继续灌流20 min。

1.6 肾脏水肿率及病理检查 灌流结束后，各组肾标本称重，计算肾脏水肿率，肾脏水肿率=(灌流后肾重-对照肾重)/对照肾重。4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、常规HE染色，光镜下观察肾小球及肾小管形态、结构。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 TNF-α对基础灌注压的影响 平衡期过后，各组基础灌注压比较无显著差异(P＞0.05)。TNF-α、2-APB预灌流时，基础灌注压无明显改变。

2.2 TNF-α对肾血管收缩作用的影响 A1、A2组ET刺激后，灌注压较基础压均明显升高(P＜0.05);A2组灌注压升高值显著高于A1组(P＜0.01)。见图1，表1。B1、B2组ET刺激后，灌注压较基础压均明显升高(P＜0.05);B2组灌注压升高值显著高于B1组(P＜0.01)。见图2，表1。C1、C2组ET刺激后，灌注压较基础压均明显升高(P＜0.05);C2组灌注压升高值显著高于C1组(P＜0.01)。见图3，表1。D1、D2组ET刺激后，肾灌注压均略升高，但与基础灌注压比较无显著差异(P＞0.05);两组灌注压升高值比较无显著性差异(P＞0.05)。见图4，表 1。

表1 各组大鼠离体肾灌注压结果(x ± s，n=7)

图1 A1、A2组肾血管灌注压的变化

图2 B1、B2组肾血管灌注压的变化

图3 C1、C2组肾血管灌注压的变化

图4 D1、D2组肾血管灌注压的变化

2.3 肾脏水肿率及病理变化 A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2组肾脏的水肿率分别为(28±2)%、(29±30)%、(28±3)%、(27±2)%、(26±3)%、(27±3)%、(29±30)%、(26±2)%，灌流后肾组织无明显器质性损伤，与灌流前相符。见图5。

图5 灌流前后肾组织HE染色(×200)

3 讨论

当HRS发生时，患者血清中许多缩血管活性物质水平明显增高，并可通过直接或间接途径引起肾血管收缩，是导致肾血流灌注和肾功能紊乱的重要介质〔4〕。近年来学者们认为:重型肝炎患者体内TNF-α浓度明显增高，是导致多脏器衰竭的重要因子，研究表明TNF-α能够通过多种途径引起血管收缩，参与相关疾病的病理生理过程:① TNF-α可通过TNFR2和ETETR依赖途径引起血管收缩。当阻断ETA、ETB受体后，TNF-α就不再有缩血管作用了〔5〕。② TNF-α抑制内皮依赖的一氧化氮-环磷酸鸟苷(NO-CGMP)途径导致血管收缩。TNF-α可活化蛋白激酶C(PKC)从而抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化;同时TNF-α可通过缩短eNOSmRNA的半衰期来下调eNOS mRNA〔6〕。③ TNF-α能够增强Ca2+依赖及非 Ca2+依赖蛋白激酶活性，从而增强血管平滑肌细胞收缩〔7〕。

本实验建立离体灌注肾模型，应用多导生理记录仪检测肾灌注压发现:肾脏经含TNF-α的Kreb液灌流后，其肾血管对ET的反应提高，表现为肾血管灌注压明显高于非TNF-α处理组。结果表明:TNF-α可增强ET的肾血管收缩作用。而Kreb液所含钙离子可通过平滑肌细胞膜上的钙通道进入胞内，从而引起肾血管灌注压增高，为排除这一因素，应用Verapamil阻断膜上的钙通道后，予含TNF-α的Kreb液灌流，其肾血管对ET的反应仍增高，肾血管灌注压仍高于非TNF-α处理组。进一步应用含TNF-α的无钙Kreb液灌流肾脏后，其肾血管对ET的反应提高，肾血管灌注压明显高于非TNF-α处理组，表明TNF-α通过增强ET引起的胞内钙释放促进肾血管收缩。

1，4，5三磷酸肌醇(IP3)是细胞间跨膜信息传递的第二信使，IP3受体(IP3R)为离子通道受体，主要分布在内质网、肌浆网上，其末端有IP3结合点。一旦IP3与IP3R结合，IP3R构象则发生改变，导致通道开放，内质网中的储备钙被释放到胞质中，以调节各种细胞的生物活性〔8〕。已知ET等血管活性物质与靶细胞膜上特异性受体(如ET受体)结合后，使膜磷脂酰肌醇4，5-二磷酸发生磷酸化生成 IP3，IP3与IP3R(胞内主要的Ca2+释放通道)结合则促进细胞内Ca2+释放，使胞内Ca2+水平增高〔9〕，引起细胞收缩。2-APB是一种常用的IP3R的阻断剂，可特异性阻断IP3R〔10〕，本实验应用含2-APB及TNF-α的无钙Kreb液灌流肾脏，其肾血管对ET的反应较差，ET刺激后的肾血管灌注压无显著变化。结果表明:2-APB可阻断TNF-α的前述作用，说明TNF-α可能通过上调IP3R进而增强ET引起的肾血管收缩。已有报道:TNF-α可诱导肾小球纤维蛋白沉积、中性粒细胞浸润、细胞凋亡，引起肾小球滤过率下降。因此实验结束后，所有的肾脏标本称重，计算其水肿率低于30%，说明灌流成功;并进行常规病理检查均未发现肾小管及肾小球细胞病理性改变，故排除了实验结果受器质性肾脏损伤影响的因素〔11〕。

综上所述，重症肝炎患者血中存在的高浓度TNF-α可能上调IP3R，促进胞内钙释放，增强肾血管对ET的收缩敏感性，造成肾脏低灌注，参与HRS发生。

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