新型丹参素衍生物的合成与抗心肌缺血活性研究

田 霖1，2a，郭海霞3，张 洁4，焦育强1，2，吴秋业2b，张 川1，2a（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.第二军医大学药学院，2a.中药鉴定教研室，2b.有机化学教研室，上海 200433；3.解放军 266医院医务处，河北 承德 067000；4.国防大学第二门诊部，北京 100039）

·论著·

新型丹参素衍生物的合成与抗心肌缺血活性研究

田 霖1，2a，郭海霞3，张 洁4，焦育强1，2，吴秋业2b，张 川1，2a（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.第二军医大学药学院，2a.中药鉴定教研室，2b.有机化学教研室，上海 200433；3.解放军 266医院医务处，河北 承德 067000；4.国防大学第二门诊部，北京 100039）

目的通过对丹参素进行结构改造，以改善其稳定性和药理活性。方法以中药提取的丹参素钠为起始化合物，经酯化反应、甲氧基保护酚羟基、硝化反应等合成新型的丹参素衍生物。建立心肌细胞缺氧模型，用M TT方法检测丹参素及其衍生物对缺氧H 9c 2细胞的保护作用。结果合成了15个全新的丹参素衍生物，并对其进行结构验证；药理活性实验显示，只有少数目标化合物在浓度为5μm o l／L时表现出强于丹参素的活性。结论多数化合物的最大药理活性未显现在所选浓度范围内，其活性未必低于丹参素，尚需做进一步探讨。

丹参素；结构修饰；合成；药理活性

丹参素为唇形科植物丹参（Salviam iltiorrhiza Bge）中的一种主要化学活性成分，化学名为D（＋）－B-（3，4-二羟基苯基）乳酸，结构式见图1。丹参素具有抑制血小板凝集［1］、抗凝血［2］、降血脂［3，4］、保肝［5，6］、抗炎［7］、扩张冠状动脉［8］、抗氧化损伤［9］、抗肿瘤［10，11］等多种药理活性，对心血管系统具有明显的保护作用，临床上多用于改善心脏功能［12，13］、抗凝血和改善微循环［14］等，是研究得比较深入的一种中药药效成分。

图1 丹参素的化学结构式

提取分离得到的丹参素水溶性强，脂水分配系数差，结构不稳定，活性不突出，从而导致成药性差。因此，前人对羟基及羧基进行了大量结构修饰。王定远等［15］对酚羟基进行了成醚和成酯保护。Dong等［16］分别对酚羟基进行了乙酰化和亚甲基化。张智波等［17］保留苯基乳酸结构，改变了苯环上的取代基，合成了不同的丹参素衍生物。崔庆彬等［18］在丹参素醇羟基部位进行修饰得到新衍生物。郑晓晖等［19］将羧基成酯，合成了丹参素冰片酯。向卓等［20］在将酚羟基乙酰化的基础上，将α-羟基也乙酰化，并且将羧基与传统抗心肌缺血的硝酸酯类药物单硝酸异山梨醇酯拼合，得到乙酰丹参素单硝酸异山梨醇酯。为进一步研究丹参素的构效关系，在对丹参素酚羟基进行甲基化的基础上，我们将吸电子基团硝基引入丹参素的苯环，可以降低苯环的电子云密度，以期增加目标化合物的稳定性。同时探索了羧基反应成不同酰胺键对丹参素结构和活性的影响，最后，在醇羟基部位成酯，考察醇羟基是否为活性必需基团。新型丹参素衍生物结构见图2。

通过对丹参素的羟基和羧基进行化学结构改造，以期获得结构稳定、脂溶性好、生物利用度更高的新型丹参素衍生物。

图2 新型丹参素衍生物的化学结构式

1 仪器与试药

1.1 仪器 R-3型旋转蒸发仪（Bu c h i公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海豫康科教仪

器设备有限公司）；85-1型磁力恒温搅拌器（上海志威电器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；JA100型精密电子天平（上海志威电器有限公司）；AC-P300型核磁共振仪（Bruker Spectmspin公司）；API-300型质谱仪（Agilent Technologies公司）；P-1020型旋光仪（Jasco公司）；YRT-3型熔点仪（天大天发科技有限公司）；CO2细胞培养箱（Thermo Fisher公司）。

1.2 试药 层析硅胶（青岛海洋化工有限公司）；无水甲醇、丙酮、浓硫酸、浓硝酸、乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、碳酸氢钠、无水硫酸钠、氯化钠（General-reagent公司）；无水碳酸钾、硫酸二甲酯（Adamas公司）；DMEM、胎牛血清（Hyclone公司）；大鼠H9c2细胞（中国科学院细胞所）；DMSO（Am resco公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；丹参素钠（第二军医大学药学院中药鉴定教研室）。

2 方法

2.1 丹参素衍生物的合成 新型丹参素衍生物的合成路线见图3。

图 3 新型丹参素衍生物的合成路线

2.2 化合物体外抗心肌缺血活性测定 通过体外缺氧模型诱导H9c2心肌细胞缺氧，提前用丹参素及其衍生物作用于细胞，观察丹参素及其衍生物在不同浓度下对心肌细胞的保护效应。实验随机分为对照组（阳性药组）、丹参素衍生物组（给药组）和模型组。

将H9c2细胞接种于96孔板中，1×105个／m l，每孔100μl，使用含10%FBS的DMEM培养基培养20～24h后，加药孵育12h，同时模型组换低糖无酚红DMEM培养基，对照组换完全培养基。给药组每个浓度设3个复孔（包括阳性药），模型组设6个复孔，每块96孔板均设阳性药组和模型组。缺氧5h，复氧1h，之后加入M TT继续培养4h，最后吸除上清液，每孔加入150m l DMSO置于摇床，至结晶完全溶解，使用酶标仪在490nm波长条件下测定OD值。

3 结果

3.1 目标化合物的波谱数据 详见表1。

表1目标化合物的波谱数据

3.2 丹参素衍生物的抗心肌缺血活性 丹参素衍生物的药理活性测定结果显示，在实验设定的浓度梯度下，大部分化合物均表现出抗缺氧活性，或随着浓度升高活性增大（化合物4、7、9、17），或随着浓度升高活性降低（化合物10、12～16、18），少数出现不规律性（化合物5、6），除化合物5、6、12、13、14、15在浓度为5μmol／L时表现出高于丹参素的活性，其余化合物的活性均低于母药丹参素，化合物8、11、16则活性较弱或没有活性。结果见表2。

4 讨论

考虑到酚羟基的不稳定性，笔者通过合成空间位阻较小的-OCH3来保护酚羟基。在构思如何修饰羧基的问题上，笔者参考了Wang［21］的实验结果，在丹参素羧基部位进行酰胺键修饰能够保持化合物的抗氧化活性，硝基的引入意在降低苯环的电子云密度，以期增加目标化合物的稳定性。起初在进行硝化反应时，采用混酸体系（HNO3-H2SO4）［22］对化合物进行硝化，不仅反应条件需要冰浴，而且产率较低，仅为28.0%左右。查阅相关文献后，改用HNO3-乙酸体系，只需在室温即可反应，后处理简单，且产率提高到78.0%。经过反复实验，硝化反应中反应物的最佳比例为：1.0g化合物2溶于22m l乙酸，同时加入1.5m l HNO3。

从药理实验整体结果看，除化合物8、11、16活性低或不具活性外，其余化合物均表现出或多或少的抗心肌缺氧活性，其中化合物5、6、12～15均在浓度为5μmol／L展现出强于丹参素的活性，而且化合物4、7、9、10、12～16、17、18随着浓度升高活性增大或减小，均未表现出最适药效浓度时的药理活性大小，需要适当扩大浓度范围做更为全面的测定。此外，硝基的选用可能也有不当，以何种取代基替换，则仍需继续合成大量化合物进行更深一步的研究。

Synthesis and anti-myocardial ischem ia activities of novel Danshensu derivatives

TIAN Lin1，2a，GUO Haixia3，ZHANG Jie4，JIAO Yuqiang1，2，WU Qiuye2b，ZHANG Chuan1，2a（1.School of Pharmacy，Fujian U-niversity of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China；2a.Department of Science for Identifying Chinese Materia Medica，2b.Department of Organic Chem istry，School of Pharmacy，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China；3.No.266Hospital of PLA，Chengde 067000，China；4.Second Out-patient Department，National Defence University，Beijing 100039，China）

ObjectiveTo design and synthesize novelDanshensu derivatives in order to improve their stability and cardioprotective effectagainstmyocardial ischemia.MethodsNovel Danshensu derivativeswere synthesized chiefly via esterification，methoxy phenol hydroxyl protection，nitration and am ine solution reaction.A ll the target compounds were evaluated their biologicaleffects on anti-myocardial ischemiaw ith H 9c2cells in vitro.Results15compoundswere synthesized and further confirmed by1H NMR and MS.Pharmacological studies showed that few synthetic derivatives at 5μmol／L performed a higher biological effect than Danshensu.ConclusionMost derivatives didn＇t show the best activity at the chosen concentration gradient that a further pharmacological trial need to be done.

Danshensu；structuremodification；synthesis；pharmacological activity

表2 丹参素衍生物对H 9c 2细胞活性的影响

R285

A

1006-0111（2015）06-0525-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.012

田 霖，硕士研究生.E-mail：sdzbtlin＠163.com.

张 川，博士，教授，博士生导师.研究方向：中药创新药物的研究.E-mail：zhangchuan＠smmu.edu.cn.