158例涂阴培阳肺结核患者分离菌株耐药情况分析

周丽平 侯双翼 刘勋 李爱国 赵丁源 杨成凤 张玉 皮琦 罗军民 彭延



·论著·

158例涂阴培阳肺结核患者分离菌株耐药情况分析

周丽平 侯双翼 刘勋 李爱国 赵丁源 杨成凤 张玉 皮琦 罗军民 彭延

目的 了解湖北省涂阴培阳肺结核患者分离菌株耐药水平，为有效控制耐药结核病提供依据。方法 采用WHO推荐的比例法，对湖北省内的4个国家级耐药监测点2013年获得的158例涂阴培阳患者的临床分离株进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，其中一线抗结核药物有异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)4种；二线抗结核药物有卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、对氨基水杨酸(PAS)、丙硫异烟胺(Pto)5种。采用Excel建立数据库，采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，对耐药率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果 分离的158 株菌株总体耐药率为18.99%(30/158)，耐多药率为1.90%(3/158)，一线药物S的耐药率最高为13.29%(21/158)，二线药物Cm的耐药率最高为3.80%(6/158)。9种药物耐药率由高到低的顺位分别为S 13.29%(21/158)、H 9.49%(15/158)、Cm 3.80%(6/158)、R 3.16%(5/158)、PAS 2.53%(4/158)、Km 1.90%(3/158)、E 1.27%(2/158)、Ofx 1.27%(2/158)、Pto 0.63%(1/158)。9种药物均出现了耐药菌株，共出现了15种不同耐药形式。4种一线药物耐药率为15.82%，与湖北省1999年耐药监测4种一线药物初始耐药率17.5%比较基本持平，差异无统计学意义(χ2=0.25,P>0.05)。结论 涂阴培阳肺结核患者分离株有较高的耐药率，应引起重视，加强监测，进行规范治疗和管理。

结核, 肺； 抗药性, 细菌； 微生物敏感性试验

我国结核病控制工作已经取得较大的成效，实现了阶段性目标，但耐药结核病的流行，为结核病的有效控制增加了难度。近年来，随着耐药结核病实验室诊断的逐步开展，全国和各省对结核病耐药情况进行了监测，但研究数据多来源于对涂阳培阳肺结核患者耐药情况的分析，对涂阴培阳肺结核患者耐药情况尚少见报道。据我国肺结核疫情报告显示，目前全国活动性肺结核患者中绝大多数为涂阴肺结核患者[1]，本研究通过收集158例涂阴培阳肺结核患者菌株进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，分析涂阴培阳肺结核患者耐药现状。

材料和方法

一、研究对象

1. 标本的来源：湖北省浠水、麻城、天门、随州4个国家级耐药监测点2013年1月1日至12月31日，共新登记活动性肺结核患者2677例，发现涂阳患者470例，涂阳检出率17.56%(470/2677)，新登记的涂阴肺结核患者2207例；新登记的涂阴患者中男1613例、女594例，最大年龄88岁，最小年龄8岁，平均年龄(49.36±17.79)岁；将每位涂阴患者收集2份质量较好的痰标本，进行分离培养，获得阳性培养物168例，涂阴培阳率为7.61%(168/2207)；将168例阳性培养物送省结核病参比实验室进行菌种鉴定和药敏试验，转种失败1例，进行菌种鉴定9株为非结核分枝杆菌，158株为结核分枝杆菌复合群；对158株结核分枝杆菌进行一、二线共9种抗结核药物的敏感性检测。

2. 新登记的涂阴培阳肺结核的界定：指从未用过抗结核药物治疗或用抗结核药物化疗不足1个月(因其他疾病应用抗结核药物治疗除外)，痰涂片检查为阴性，痰培养检查为阳性的肺结核。

二、实验方法

1．涂片、培养和菌种鉴定： 按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》[2]进行。

2. 药敏试验： 采用WHO《结核病药物耐药性监测指南》[3]推荐的比例法对分离菌株进行药敏试验检测。对异烟肼(H)、利福平(R)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)4种一线抗结核药物和卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、对氨基水杨酸(PAS)、丙硫异烟胺(Pto)5种二线抗结核药物进行检测。各含药培养基内的药物浓度分别为：H 0.2 μg/ml，R 40 μg/ml，S 4 μg/ml，E 2 μg/ml，Km 30 μg/ml，Cm 40 μg/ml，Ofx 2.0 μg/ml，PAS 1.0 μg/ml，Pto 40.0 μg/ml。结果判定：以试验管(含药培养基)菌落数与对照管(不含药培养基)菌落数之比计算耐药百分比，若耐药百分比>1%则认为受试菌对该抗结核药物耐药，<1%则为敏感[3-5]。

3．实验材料：抗酸染色液、酸性罗氏培养基、改良罗氏培养基、菌种鉴定培养基和含药培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司，结核分枝杆菌标准株H37Rv由国家结核病参比实验室提供。

三、质量控制

(1) 涂片镜检和培养的质量保证按常规国家相关规定执行[6-7]。(2) 药敏试验由国家参比室对湖北省结核病参比实验室进行药敏试验质量控制，参比室药敏试验结果符合率达到要求，方可对收集临床株进行耐药性检测。(3)每批药敏试验均用结核分枝杆菌标准株(H37Rv敏感株)检测含药培养基的质量。试验中，若高稀释度菌液在对照培养基上生长<20 CFU/ml，则从对照管传代培养，重复试验。

四、统计学分析

采用Excel建立数据库，对所有数据进行双人录入和复核，采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，对耐药率的比较进行卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、抗结核药物在158例涂阴培阳患者中的耐药率

在158例涂阴培阳菌株中，敏感菌株128株，耐任一药物菌株30株，总耐药率为18.99%(30/158)，耐多药(至少同时耐R+H)菌株3株，耐多药率为1.90%(3/158)。其中不同形式耐4种一线药物的耐药率为15.82%(25/158)，与我省1999年全省耐药监测4种一线药物初始耐药率17.5%基本持平，差异无统计学意义((χ2=0.25,P>0.05)。5种二线药物的耐药率6.96%(11/158)，4种一线药物加Ofx和Km 2种二线药物的耐药率为17.72%(28/158)。9种药物耐药率由高到低的耐药顺位依次为S、H、Cm、R、PAS、Km、E、Ofx、Pto；S的耐药率最高[13.29%(21/158)]，Pto的耐药率最低[0.63%(1/158)]，二线药物中Cm的耐药率最高[3.80% (6/158)](表1)。

二、不同抗结核药物的耐药形式在158例涂阴培阳患者中的耐药率

9种药物均出现了耐药菌株，30株耐药菌株共出现了15种不同耐药形式，其中单耐药13株，占43.33%(13/30)，多耐药14株，占46.67%(14/30)，耐多药3株,占10.00%(3/30)，对R耐药的5株菌株中3株同时耐H， 没有出现广泛耐药菌株(表2)。

表1 9种抗结核药物在158例涂阴培阳患者中的耐药率

表2 不同抗结核药物的耐药形式 在158例涂阴培阳患者中的耐药率

三、不同特征涂阴培阳患者的耐药情况

患者从未用过药与用药<1月，耐药率分别为19.01%(27/142)和18.75%(3/16)，耐药率之间差异无统计学意义(χ2=0.00,P>0.05)。不同性别患者耐药率分别为男19.66%(23/117)、女17.07%(7/41)，耐药率之间差异无统计学意义(χ2=0.20,P>0.05)。男女的各个年龄组的耐药率情况见表3。

讨 论

我国是全球22个结核病流行严重的高负担国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的高负担国家之一[8]，耐药结核病的增多与传播已成为全球结核病发病率急骤上升的原因之一，特别是耐多药肺结核的发生对结核病的控制造成了极大的威胁[9]，掌握结核病疫情和结核分枝杆菌耐药情况，对结核病预防与控制具有非常重要的意义。目前国内外耐药监测报道均以涂阳肺结核患者及分离菌株耐药情况为主，本研究对涂阴培阳肺结核患者耐药情况进行了分析。

一、耐药疫情较严重，应加强耐药监测

本次涂阴培阳肺结核患者分离的158株菌株中，9种药物总耐药率为18.99%，4种一线药物耐药率为15.82%，耐多药率为1.90%，与我省1999年全省耐药监测4种一线药物初始耐药率17.5%(χ2=0.25,P>0.05)和初始耐多药率2.1%(χ2=0.03,P>0.05)比较基本一致[10]。4种一线药物加2种二线药物(Ofx和Km)总耐药率17.72%，略高于2008年全球72个国家和地区初治涂阳17.00%的平均总耐药率[11]。说明湖北省涂阴培阳肺结核患者分离株耐药率较高，耐药疫情比较严重，应进一步加强患者的发现、治疗与管理，加强结核病患者的耐药监测。

二、耐药谱广泛，耐药顺位发生变化

9种药物均出现了耐药菌株，且出现了15种不同耐药形式，说明涂阴培阳菌株耐药谱广泛。耐药率顺位前五位为S、H、Cm、R、PAS，其中仍然以S耐药率为高，目前结核病常规治疗方案中， S不再是

表3 各年龄组不同性别涂阴培阳患者临床分离株耐药率

应用于患者治疗的必选药物，因此S高耐药可能与早期主要应用S抗结核和抗炎治疗有关，同时抗结核药物治疗不超过1个月与未用过抗结核药物治疗患者的分离株耐药情况无差别，均说明患者很可能是由于既往感染了具有耐药性的菌株，为原发耐药，原发耐药是耐药结核病产生的重要原因[12]。二线药物中Cm、PAS耐药率排位靠前，Cm排在总顺位第三位，5种二线药物均出现耐药，说明我省二线药物使用广泛，有待规范，二线药物耐药形式不容乐观。R耐药的5株菌株中同时耐H的3株，提示加强涂阴培阳患者的R耐药监测有利于提高耐多药患者的发现。

三、年龄组间耐药率差异有统计学意义

经过单项有序卡方检验，年龄对药敏试验结果的影响差异有统计学意义。0～岁年龄组耐药率最低(0.00%)，20～岁年龄组耐药率最高(29.27%)。与李静等[13]、党丽云等[14]、何佩贤等[15]报道的情况类似，可能与该年龄段人群生活压力大、生活不规律、一些不良的生活习惯等导致其抵抗力下降，以及流动性大、集体工作生活机会多导致感染机会增多，治疗依从性较差等因素有关。在我国改革开放、经济发展的新形势下耐药趋势在发生改变，应加强对20～岁年龄段，特别是男性20～岁年龄段耐药情况的研究，及时采取干预措施。

涂阴培阳患者实际上是痰涂片检查时没被发现而通过培养的方法发现的细菌学阳性患者。2010年全国第五次结核病流行病学调查显示，活动性患者中涂阴患者占85.65%，其中涂阴培阳率为14.17%，占活动性患者的比例为12.14%[1]，本研究涂阴培阳率达到7.61%，说明活动性患者中存在相当数量的涂阴培阳患者，亦存在一定数量的耐药患者，应关注涂阴培阳患者对结核病疫情及耐药结核病疫情的影响。

通过对涂阴培阳患者耐药情况的分析，发现涂阴培阳患者耐药情况比较严重，提示我们在结核病防治规划制定和结核病防治策略实施过程中应重视涂阴肺结核患者的发现，将痰培养检查纳入结核病常规检查项目，提高涂阴培阳患者的发现率，加强涂阴培阳患者的耐药监测，及早发现耐药患者，选择适当的治疗方案，规范的进行治疗和管理，从而有效避免涂阴患者因治疗不当所致的治疗失败，避免耐多药和广泛耐多药患者的产生。

[1] 全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组 全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室．2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告.中国防痨杂志，2012，34(8)：485-508.

[2] 中国防痨协会基础专业委员会.结核病诊断实验室检验规程．北京：中国教育文化出版社，2006:46-65.

[3] Mohamed AA，Adalbert L，Mario R，et al. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis．2nd ed．Geneva：World Health Organization，2003：l-71．

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[5] World Health Organization．Policy guidance on．drug-susceptibility testing(DST)of second-line anti tuberculosis drugs．WHO/HTM/TB/2008．392．Geneva：World Health Organization，2008．

[6] 赵雁林，姜广路，夏辉，等.痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册.北京：中国协和医科大学出版社，2008:18-39.

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[11] 中华人民共和国卫生部．全国结核病耐药性基线调查报(2007—2008年)．北京：人民卫生出版社，2010：l-57．

[12] 梅建，薛桢，沈鑫，等．原发耐药是耐药结核病产生的重要原因．中华结核和呼吸杂志，2006，29(2):75-78.

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[14] 党丽云，魏香兰，方如塘，等.4721例住院肺结核患者耐药状况及危险因素分析.中国防痨杂志，2014，36(1)49-54.

[15] 何佩贤，黎婉媚，康莉娟.321例耐多药结核病耐药情况分析.中国防痨杂志，2012，34(8)：514-518.

(本文编辑：王然 薛爱华)

Drug resistance analysis of 158 isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive tuberculosis

ZHOULi-ping,HOUShuang-yi,LIUXun,LIAi-guo,ZHAODing-yuan,YANGCheng-feng,ZHANGYu,PIQi,LUOJun-min,PENGYan.

InstituteforTuberculosisControlandPrevention,HubeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan430079,China

PENGYan,Email: 68633845@qq.com

Objective To understand the drug-resistant level of strains isolated from patients with smear-ne-gative and culture-positive tuberculosis (TB) in Hubei, and to provide basis for effectively control drug-resistant TB. Methods Proportion method recommended by World Health Organization (WHO) was applied. Drug susceptibility test (DST) of H, R, S, E (the first-line anti-TB drugs) and Km, Cm, Ofx, PAS, Pto (the second-line anti-TB drugs) for 158 isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive TB from 4 national drug-resistance monitoring sites in Hubei in 2013 was conducted. Database was established using Excel. Statistical analysis was performed with SPSS 16.0. Chi-square test was used to test drug-resistance rate withP<0.05 as statistically significant difference. Results The overall drug-resistance rate of 158 strains was 18.99% (30/158), and the multi-drug resistant rate was 1.90% (3/158). Specifically, the drug-resistance rates of S and Cm were 13.29% (21/158) and 3.80% (6/158), which were respectively the highest among the first line and the second line drugs. Moreover，the drug-resistance rates of 9 drugs from high to low were S 13.29% (21/158), H 9.49% (15/158), Cm 3.80% (6/158), R 3.16% (5/158), PAS 2.53% (4/158), Km 1.90% (3/158), E 1.27% (2/158), Ofx 1.27% (2/158) and Pto 0.63% (1/158). Drug-resistant strains appeared to 9 drugs, and there were a total of 15 different forms of resistance. All in all, the drug-resistance rate of 4 kinds of first-line drugs was 15.82%, which kept basically balance with the monitoring data 17.5% in Hubei in 1999 (χ2=0.25,P>0.05). Conclusion The drug resistance rates of the isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive TB are higher, which should be paid attention to, we should strengthen surveillance, and standardize treatment and management as well.

Tuberculosis, pulmonary； Drug resistance, bacterial； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.011

430079 武汉， 湖北省疾病预防控制中心结核病防治研究所

彭延，Email: 68633845@qq.com

2015-01-29)