γ-干扰素释放试验在肺结核与非结核分枝杆菌肺病诊断的价值

黄艳君 谭耀驹 蔡杏珊 刘燕文 竺澎波



·论著·

γ-干扰素释放试验在肺结核与非结核分枝杆菌肺病诊断的价值

黄艳君 谭耀驹 蔡杏珊 刘燕文 竺澎波

目的 评估γ-干扰素释放试验(IGRAs)在诊断肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)与非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria, NTM)肺病中的价值。 方法 收集2013年3月至2014年6月期间广州市胸科医院住院患者214例，共分3组：PTB组87例，NTM肺病组70例和其他肺部疾病组57例。应用结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)试剂盒进行γ-干扰素释放试验，检测各组外周血淋巴细胞对结核分枝杆菌菌种特异性分泌蛋白：早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)的免疫反应情况。 结果 T-SPOT.TB结果显示87例肺结核患者77例阳性(阳性率88.51%)，70例NTM肺病患者16例阳性(阳性率22.86%)，57例其他肺部疾病患者13例阳性(阳性率为22.81%)，PTB组T-SPOT.TB 阳性率明显高于NTM肺病组(χ2=69.23，P<0.01)和其他肺部疾病组(χ2=63.42，P<0.01)，差异均有统计学意义，而NTM肺病组和其他肺部疾病组阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.00，P=1.00)。 结论 T-SPOT.TB可快速辅助诊断肺结核和NTM肺病。

干扰素γ释放试验； 结核, 肺/诊断； 分枝杆菌感染, 非结核； 肺疾病

肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)与非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)肺病的细菌学诊断主要有抗酸菌涂片镜检、分枝杆菌分离培养和菌种鉴定等常规方法，这不仅是发现传染源的最主要手段，同时也是确诊结核病和NTM肺病、选择治疗方案、考核疗效及评价防治效果的金标准。但以上方法一直存在阳性率低、耗时长的问题，其缺点在NTM肺病的诊断中尤为突出。目前诊断NTM的技术还十分滞后，最突出的是实验室质量控制较差，导致分枝杆菌假阳性率和假阴性率升高；实验室菌种鉴定水平不高，使得近1/4的NTM肺病误诊为结核病[1]。可见，传统的细菌学方法在总体上已不能满足结核病与NTM肺病的诊断及鉴别诊断。所以，准确、快速及简便的早期诊断技术是NTM肺病诊断亟待解决的问题。γ-干扰素释放试验(IGRAs)目前已经列入美国和欧洲等地结核病诊疗指南，以协助诊断结核分枝杆菌感染的存在[2-3]。本研究回顾分析2013年3月至2014年6月广州市胸科医院的住院患者进行结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测情况，结合临床诊断，评估其在肺结核和NTM肺病诊断中的价值。现将结果报告如下。

材料和方法

一、研究对象

收集2013年3月至2014年6月在广州市胸科医院分枝杆菌培养菌种鉴定确诊为肺结核的患者87例，年龄9～91岁，平均年龄为(49.72±20.51)岁。NTM肺病患者70例，年龄19～87岁，平均年龄为(61.01±14.56)岁，菌种鉴定分别是：胞内分枝杆菌(M.intracellulare)20例、龟-脓肿复合群分枝杆菌(M.chelona/abscessuecomplex) 28例、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii) 8例、鸟-胞内复合群分枝杆菌(M.avium-intracellularecomplex, MAC) 5例、鸟分枝杆菌(M.avium)9例；排除结核病和NTM肺病的其他肺部疾病患者57例，年龄4～94岁，平均年龄为(47.19±21.58)岁，包括：肺炎、肺炎支原体性肺炎、肺真菌感染、细菌性肺炎和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等。患者的诊断标准及临床一般情况见表1。

二、方法

入组的214例，均进行血T-SPOT.TB检测。

1. γ-干扰素释放试验：根据试剂盒(T-SPOT.TB, Oxford Immunotec公司，英国)说明书进行操作，从外周静脉血中分离出单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，在每个预包被抗γ-干扰素抗体的孔中加入2.5×105个PBMCs，分别与两种抗原[早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)]共同孵育16～20 h，利用碱性磷酸酶偶联的二抗和底物显色后，使用酶联免疫斑点(ELISPOT)读板仪对斑点进行计数。

2. 质量控制：IGRA实验质量控制为确保每个反应孔有均一定量的细胞数，每一反应均分别设有阳性对照和阴性对照，对照孔正常(阴性孔≤10个，阳性孔≥20个)的情况下，按以下标准判断结果。阳性结果: (1) 如果空白对照孔斑点数<6个, 检测孔斑点数减去空白对照孔斑点数>6; (2)如果空白对照孔斑点数≥6个, 检测孔斑点数必须>2倍的空白对照孔斑点数。反之，为阴性结果。阴性或阳性对照异常，试验均视为无效。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，分析参数包括敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比，用χ2检验比较组间的差异性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

T-SPOT.TB在不同组别的检测情况：PTB组阳性率88.51%、NTM肺病组阳性率22.86%、其他肺部疾病组阳性率22.80%。数据显示，PTB组的阳性率明显高于另外2个组，差异有统计学意义(P=0.00)(表2～4)。

表1 214例不同肺部疾病患者性别、年龄和诊断依据

注 肺结核诊断参照《肺结核诊断标准》(WS288-2008)[4]执行；肺外结核和非结核分枝杆菌肺病参照中华医学会结核病分会《肺结核诊断和治疗标准》[4]执行；a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原体性肺炎、肺真菌感染、细菌性肺炎和COPD等，依据国家相关的疾病诊断标准执行。①是微生物学确诊；②是指南确诊；③是临床诊断；M.intracellulare：胞内分枝杆菌；M.chelona/abscessuecomplex：龟-脓肿复合分枝杆菌；M.kansasii：堪萨斯分枝杆菌；M.avium-intracellularecomplex (MAC)：鸟-胞内复合分枝杆菌；M.avium：鸟分枝杆菌

表2 PTB组与NTM肺病组的T-SPOT.TB检测结果比较

注 PTB组与NTM肺病组比较：χ2=69.23，P=0.00；敏感度为88.51%，特异度为77.14%，阳性预测值(PPV)为82.80%，阴性预测值(NPV)为84.38%,阳性似然比(LR+)为4.81，阴性似然比(LR-)为0.19，差异有统计学意义

表3 PTB组与其他肺部疾病组的T-SPOT.TB 检测结果比较

注 PTB组与其他肺部疾病组比较：χ2=63.42，P=0.00；敏感度为88.51%，特异度为77.19%， 阳性预测值(PPV)为85.56%，阴性预测值(NPV)为81.48%, 阳性似然比(LR+)为5.92， 阴性似然比(LR-)为0.23，差异有统计学意义。a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原体性肺炎、肺真菌感染、细菌性肺炎和COPD等

表4 NTM肺病组与其他肺部疾病组的T-SPOT.TB 检测结果比较

注 NTM肺病组与其他肺部疾病组比较：χ2=0.00，P=1.00；差异无统计学意义。a:其他肺部疾病包括肺炎、肺炎支原体性肺炎、肺真菌感染、细菌性肺炎和COPD等

讨 论

一、 目前实验室诊断PTB和NTM肺病的主要方法

对于肺结核的诊断，主要是依靠患者的症状、结核病接触史、影像学检查、PPD皮肤试验(tuberculin skin test, TST；结核菌素皮肤试验)及痰结核分枝杆菌培养。PPD皮试试验检测特异度较低，同时不能排除NTM的感染[5]；其次，TST对潜伏性结核分枝杆菌感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的敏感度一般，而且对于免疫抑制者的检测结果难以确定。而痰结核分枝杆菌培养虽为诊断肺结核的金标准，但较为费时且阳性率较低。另一方面，目前对疑似NTM肺病的患者，在细菌学上的诊断方法主要是留取相应病变部位标本进行涂片的抗酸染色和分枝杆菌培养，在菌种鉴定结果出来以前，结果也与肺结核结果相似，容易导致误诊。对患者而言，耽误最佳治疗时间的同时，也消耗了大量费用甚至可能会对身体造成一定程度的伤害。

二、T-SPOT.TB的检测原理及本研究的相关数据分析

T-SPOT.TB是利用结核分枝杆菌感染者外周血单个核细胞中存在结核特异的效应T淋巴细胞，这些淋巴细胞在再次受到结核分枝杆菌特有的DNA片段所编码的ESAT-6和CFP-10刺激后分泌γ-干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验，与卡介苗、特别是非结核分枝杆菌无交叉反应，因此，具有非常高的敏感度和特异度[4-5]，同时可以检测到还没有临床症状的LTBI患者，很多研究已经证实了此原理可应用于结核病、包括肺外结核的辅助诊断[7-10]及结核病的排查。

本研究显示，菌阳PTB组T-SPOT.TB试验阳性率为88.51%，能明显与涂阳、培阳的NTM肺病组(阳性率为22.86%)进行鉴别诊断，两组比较：敏感度为88.51%，特异度为77.14%，阳性预测值(PPV)为82.80%，阴性预测值(NPV)为84.38%,阳性似然比(LR+)为4.81，阴性似然比(LR-)为0.19，差异有统计学意义(P=0.00)。在其他肺部疾病组中，T-SPOT.TB试验阳性率为22.81%，明显低于PTB组，两组比较：敏感度为88.51%，特异度为77.19%，PPV为85.56%，NPV为81.48%，LR+为5.92， LR-为0.23差异有统计意义(P=0.00)。可见，T-SPOT.TB可以应用于PTB与其他体征和检查结果相似的疾病，特别是NTM肺病的早期鉴别诊断[11]；当然，更可作为PTB诊断的一项重要的筛查指标。通过对NTM肺病组和肺部其他疾病组的T-SPOT.TB结果比较，显示差异无统计学意义(P=1.00)，说明T-SPOT.TB在其他肺部疾病患者和NTM肺病患者中的检测结果情况基本一致。T-SPOT.TB目前主要的试验标本是静脉血和胸腹积液，标本留取简单、方便且合格率高，试验过程中提取经洗涤的定量PBMCs进行孵育刺激，去除了外源干扰素干扰的同时也使结果更准确。

综上所述，T-SPOT.TB在结核病与NTM肺病的诊断过程中有快速、敏感度及特异度较高的优点[11]，在临床上对疑似肺结核的患者进行T-SPOT.TB检测对鉴别诊断是有帮助的。此外，由于胸腔积液中免疫反应的强度比血液中更高，因此有些试验通过检测胸腔积液中的γ-干扰素释放水平来诊断活动性胸膜结核[12]，这些尝试被证实是有意义的。对于本试验结果的反应强度与病情的相关性，目前仍存在较大的争议。本试验全过程只要2 d时间，取材简便且合格率高，但鉴于目前T-SPOT费用还比较高，在一定程度上限制了该技术的临床应用。

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(本文编辑：范永德)

Performance of the γ-interferon release assay in diagnosing tuberculosis and nontuberculous mycobacteria

HUANGYan-jun，TANYao-ju,CAIXing-shan,LIUYan-wen,ZHUPeng-bo.

GuangzhouChestHospitalClinicalLaboratory,Guangzhou510095,China

TANYao-ju,Email:gzchtan@163.com

Objective To evaluate the value of interferon-gamma release assays (IGRAs) for diagnosing pulmonary tuberculosis (PTB) and nontuberculous mycobacteria (NTM). Methods A total of 214 in-patients were enrolled in this study between March 2013 and June 2014. The patients were divided into three groups: 87 PTB cases, 70 NTM cases and 57 cases with other lung diseases. T-SPOT.TB was used to detect the immune response of peripheral blood lymphocytes against tuberculosis-specific secretory proteins ESAT-6 and CFP-10. Results T-SPOT.TB tests were positive in 77 (88.51%) of the 87 TB cases, 16 (22.86%) of the 70 NTM cases, and 13 (22.81%) of the 57 cases with other lung diseases. The positive detection rate for the TB group was significantly higher than that for the NTM group (χ2=69.23，P<0.01) and other lung disease group (χ2=63.42，P<0.01). However, there was no significant difference in the positive detection rate between the NTM and other lung disease groups (χ2=0.00，P=1.00). Conclusion T-SPOT.TB can be used as an alternative auxiliary diagnostic method for distinguishing PTB and NTM patients.

Interferon-gamma release tests； Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Mycobacterium infections, nontuberculous； Lung diseases

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.007

广州市科技计划项目(201508020007)

510095 广州市胸科医院检验科

谭耀驹，Email：gzchtan@163.com

2015-04-30)