2，3－丁二醇与水杨酸诱导匍匐翦股颖对镰刀菌枯萎病的抗性

房媛媛，马晖玲

（甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070）

匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）为多年生草本植物，是一种草质细腻，耐频繁低度修剪的冷季型草坪草，广泛用于高尔夫球场、草地网球场、草地保龄球场等精细草坪，以及庭园、公园等养护水平较高的绿地。但匍匐翦股颖抗病性较差，易感染币斑病（Sclerotinia homoeocarpa）、褐斑病（Rhizoctonia solani）、镰刀菌枯萎病（Fusarium oxysporum）等［1］。传统抗病育种方法育种周期长，亲本材料获取有限，对病害只有一定预防作用［2］。化学防治成本较高，易污染环境，病原物易对杀菌剂产生耐药性甚至抗药性，大量喷施后在土壤中累积，严重污染环境，进而直接影响人类的健康［3］。

诱导植物抗病性是利用物理、化学以及生物的方法，预先处理植物，改变病害反应，使原来感病部位产生局部的或系统的抗病性现象。有关植物抗病性诱导的机理，目前，普遍认同的有两种方式，即系统获得抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR）。有害病原物初次侵染后可在植物体内激发出一种系统性抗性，植物体未受侵染部位对致病菌（病毒、真菌、细菌）产生广谱抗性，这种需要水杨酸（SA）进行信号传导的系统性诱导抗性称为系统获得抗性（SAR）［4］。对植物的SAR已进行了大量研究，SAR由SA介导，可以被一些植物激发子激活如苯并噻二唑（BTH）［5］、SA、甲基茉莉酸、苯丙 噻 重 氮、草 酸［6，7］、壳 聚 糖［8］等。Goarlach 和Friedrich等于1996年分别在小麦和拟南芥的研究中报道了 BTH 可引起系统获得性抗性［9，10］。2003年Lee等［11］报道了BTH可诱导3个品种的匍匐翦股颖对核盘菌（Sclerotinia homoeocarpa）引起的币斑病产生抗病性，但对其他品种如L－93，BTH是无效的。

诱导系统抗性（ISR）则是由分布在植物体根部的非致病性根际促生菌激活，依赖茉莉酸/乙烯（JA/ET）信号传导途径［4］。Ryu等［12］研究认为，植物根际促生菌分泌的可挥发性有机物2，3－butanediol及其同分异构体在诱导植物产生抗病性的过程中具有重要的作用。2，3－丁二醇存在3种旋光异构体中，分别为D－（－）－2，3－丁二醇、L－（＋）－2，3－丁二醇和 meso－2，3－丁二醇，常温下是一种无色无味的透明液体，微生物常形成异构体混合物。2010年，加拿大学者 Cortes－Barco［13］报道了BDO（2R，3R－butanediol）和PC1（异链烷烃混合物）根部施入植株体后可抑制分别由真菌Sclerotinia homoeocarpa，Rhizoctonia solan和Microdochium nivale引起的3种草坪叶病发生。Hsiang等［14］研究认为，2R，3R－BD等其他异链烷烃混合物诱导植物产生抗病性的机制是ISR［14］，其抗病信号传导物质，抗病基因，病程相关蛋白均不同于系统获得抗性（SAR）。但2，3－butanediol及其同分异构体诱导不同植物对多种病原菌产生抗性具有个体差异性，诱导剂的施用浓度及其作用机理还需进一步研究。

研究采用SAR机制诱导剂水杨酸（SA）和ISR机制诱导剂2，3－丁二醇（2，3－BD立体异构体的混合物），进行两种诱导剂对匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病的抗病性诱导，对比两种机制抗病诱导剂施用于匍匐翦股颖的作用效果，以期为匍匐翦股颖抗性诱导机制的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试匍匐翦股颖品种为Penn－A4，由北京克劳沃公司提供。诱导剂2，3－BD购自西亚试剂。SA购自天津光复化工。匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病病原物为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），由甘肃农业大学草业学院植物病理实验室提供。

1.2 不同浓度2，3－BD与SA对匍匐翦股颖枯萎病的抗性诱导

240mL组培瓶装入灭菌的沙土混合物（1∶2）约50mL。种子浸泡5h后，70%乙醇溶液浸泡1min，10%次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗6～7次，每瓶0.3g种子，种植于组培瓶，25±2℃组培室中培养，光周期为16h/d。

2，3－BD设置浓度梯度为150、250、350、450、550 μmol/L（c1，c2，c3，c4，c5）；SA 设置浓度梯度0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L（C1，C2，C3，C4，C5）；不用诱导剂处理只接菌为CK。种植后第8d，将10mL的2，3－BD注射入匍匐翦股颖根部土壤，8mL的SA喷施至叶面，CK用灭菌水代替。

尖孢镰刀菌在康乃馨叶片琼脂培养基（CLA），25℃条件下培养7～10d产生分生孢子，用无菌水冲洗得到孢子悬浮液，再用血小球计数板计数，将孢子悬浮液稀释到2×106个/mL浓度备用。匍匐翦股颖经诱导剂处理后第7d，尖孢镰刀菌孢子悬浮液（浓度为1×106个/mL）喷至匍匐翦股颖根部土壤（至土壤湿润），每瓶7mL。接种后并在28℃黑暗培养1d，之后在26～27℃的组培室培养。

1.3 病情调查及抗病效果

接种后第7，14和21d，统计病叶率并计算病情指数，匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病分级标准为：0级：无症状；1级：病斑面积占全株叶片面积的10%以下；2级：病斑面积占全株叶片面积的10%～40%；3级：病斑面积占全株叶片面积的40%～60%；4级：病斑面积占全株叶片面积的60%～80%；5级：全部植株普遍感病［15，16］。

2 结果与分析

2.1 不同浓度2，3－BD处理对匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病病情指数的影响

接菌后随时间延长，CK与各处理的病情指数都呈上升趋势，但适宜浓度的2，3－BD处理可明显降低镰刀菌枯萎病的病情指数。不同浓度2，3－BD处理匍匐翦股颖幼苗，接种尖孢镰刀菌第7d发病不明显，处理与CK的病情指数差异不显著（图1）。第14d叶片可观察到明显病斑，2，3－BD各处理C5除外，其他处理的病情指数显著低于CK。接菌后第21d以CK发病明显，2，3－BD各处理C2、C3、C4的病情指数显著低于CK，其中C2的病情指数最低，为20，与CK相比降低了78%。筛选得到C2（250μmol/L）为2，3－BD诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病的最佳浓度。接菌后第21d，250μmol/L的2，3－BD诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病的发病状况见图2。

图1 不用浓度2，3－丁二醇处理下匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病病情指数Fig.1 The disease index of creeping bentgrass treated with different concentrations of 2，3－BD

图2 250μmol/L的2，3－BD诱导匍匐翦股颖接种尖孢镰刀菌第21d发病状况Fig.2 Disease occurring of creeping bentgrass treated with2，3－BD at 250μmol/L on 21st day

2.2 不同浓度SA处理对匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病病情指数的影响

不同浓度SA处理匍匐翦股颖幼苗，接种尖孢镰刀菌第7d发病不明显，处理与CK的病情指数差异不显著（图3）。在病斑明显的第14d叶片可观察到明显病斑，但各处理与CK间差异不显著。接菌后第21d，各处理与CK发病明显，CK病情指数最高，为92，且与C1、C4、C5差异不显著。C2，C3的病情指数虽显著低于CK，但其病情指数分别高达86.67、81.4。SA不能诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病。

图3 不同浓度SA处理下匍匐翦股颖镰刀菌枯萎病病情指数Fig.3 The disease index of creeping bentgrass under different concentrations of SA

2.3 不同浓度2，3－BD与SA处理对匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病抗病效果的分析

接菌后第21d的诱导效果表明（表1），2，3－BD各处理中C2、C3、C4的诱导效果显著高于CK，其中C2诱导效果显著高于CK与其他处理，诱导效果为78.26%。说明2，3－BD的C2（250μmol/L）处理能够有效诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病。SA各处理中C3（0.5mmol/L）诱导效果最佳，诱导效果仅为11.52%，且与C2、C4差异不显著，诱导效果不明显。

表1 不同浓度2，3－BD与SA诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病诱导抗病效果的比较Table.1 The effect of induced disease resistance by 2，3－BD and SA

3 讨论

3.1 2，3－BD与SA作用下匍匐翦股颖抗病性诱导效果的分析

SA的5个浓度中，0.5mmol/L诱导病情指数最低，为86.67，抗病效果仅为11.52%，说明SA不能诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病。Lee［11］使用SAR机制诱导剂BTH诱导匍匐翦股颖品种Crenshaw，Penncross和Providence抗币斑病，但对其他品种如L－93，BTH是无效的。表明SAR机制诱导剂在诱导匍匐翦股颖产生抗病性时具有其自身缺陷，可能是因为SAR机制诱导剂所要诱导表达的抗病相关基因与匍匐翦股颖中的抗病基因不完全吻合。

在接菌后发病明显的第21d，2，3－BD的5个浓度中，250μmol/L的病情指数显著低于其他处理与CK，诱导匍匐翦股颖抗病效果可达78.26%，说明该浓度2，3－BD可有效诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病。Cortes－Barco使用ISR 机制诱导剂 BDO（2R，3R－butanediol）和PC1（异链烷烃混合物）诱导匍匐翦股颖对分别由真菌Sclerotinia homoeocarpa，Rhizoctonia solani和Microdochium nivale引起的3种草坪叶病产生抗性，施入PC1或BDO可减少匍匐翦股颖叶病区域约20%～40%［13］。由此可见，ISR机制诱导剂在诱导匍匐翦股颖抗病性，具有高效、持久等特点。

3.2 2，3－BD用于诱导植物产生抗病性的有效构型分析

研究结果表明，2，3－butanediol立体异构体的混合物2，3－BD能够有效诱导匍匐翦股颖产生抗病性。2，3－丁二醇的3种同分异构体中，左旋体2R，3R－BD可以诱导 烟草抗 E.carotovorasub sp.carotovora SCC1，但不能够对P.syringaepv.tabaci产生抗性，其右旋体2S，3S－BD则对植物体没有作用［17］。而 Choong－Min等研究认为2，3－butanediol的外消旋体（2R，3R－BD与2S，3S－BD 的混合物）可诱导拟南芥产生ISR［18］。综上所述，2，3－butanediol及其同分异构体诱导不同植物对多种病原菌产生抗性具有个体差异性，不同诱导剂的作用机理还需进一步研究。

3.3 2，3－BD诱导匍匐翦股颖抗镰刀菌枯萎病的有效浓度分析

诱导剂的不同使用浓度对不同植物病害的防治效果差异显著［19］。研究结果表明，250～450μmol/L的2，3－BD均对匍匐翦股颖有一定的诱导作用，其中250 μmol/L的2，3－BD的抗病效果显著高于其他处理，表明施用诱导剂浓度的重要性。Song使用2R，3R－BD诱导烟草的ISR，设置1mg/株～100pg/株不同剂量，结果表明，2R，3R－BD 的剂量为100μg/株时抵抗由E.carotovora引起的软腐病效果最佳，当剂量小于10 pg/株时不能诱导烟草产生ISR［16］。Cortes－Barco等的研究表明，100μmol/L的2R，3R－BD可诱导本氏烟草抗由C.orbiculare引起的炭疽病，叶面病害面积降低77%［20］。试验结果表明微量浓度的2，3－BD及其同分异构体能够诱导植物产生ISR。

使用诱导剂诱发匍匐翦股颖抗病性，克服了抗病育种年限长、化学防治易造成环境污染和病菌的抗药性等诸多缺点，具有抗性稳定、持久、不污染环境等优点。诱导植物抗病性涉及植物体内复杂的反应过程，在对诱导剂类型及诱导过程中信号分子类型、传导途径及抗病相关基因表达进行研究的同时，还需完善诱导剂的生物活性筛选体系、田间药效实验技术［21］。新型诱导剂产品的研发与应用，将为开展节能、环保和低碳的草坪管理理念和市场运作模式提供技术支撑［22］。

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