瞄准DNA根治疾病

刘卫

生命的核心是遗传物质，也即脱氧核糖核酸（DNA），人的DNA包裹在细胞核中，一个人的DNA包含了其所有的生命和遗传信息。现在，研究人员已经能通过对DNA编（剪）辑来根治人的疾病，甚至可能操控生命。

编辑DNA的利器

编辑DNA需要工具，这些工具实际上就是一些蛋白酶，它们可以在特定的位置切割和编辑基因，因此也可以视它们为基因剪刀。现在，最厉害的基因剪刀或基因编辑器是CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。CRISPR的全称是，规律间隔成簇短回文重复序列，最初是研究人员在一些细菌基因组中发现的，它们是一系列成簇排列的DNA序列。

Cas是Caspase的简称，全称是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。它是一组对底物天门冬氨酸部位有特异水解作用、活性中心含半胱氨酸的蛋白酶。目前已发现该蛋白酶家族共有13个，其中起凋亡启动子作用的有Cas8、9、10，起凋亡效应子作用的有Cas3、6、7。从本质上来看，酶也是一种蛋白。Cas蛋白与真核细胞的凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。

问题的关键是，CRISPR与Cas9结合能准确切割和编辑基因。研究人员早就发现，CRISPR与很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。进一步的研究发现，噬菌体DNA的这些序列在被转录成为核糖核酸（RNA）后，就成为靶向RNA（gRNA），能够和细菌产生的Cas蛋白形成复合体，并引导Cas蛋白。当复合体检测到入侵的噬菌体DNA和靶向RNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。所以，Cas蛋白实际上就是一把基因剪刀，可以用来对抗入侵的病毒及外源性DNA。

当CRISPR与Cas9结合成为CRISPR-Cas9系统时，就成为一种有目的和能精确控制的基因剪刀。Cas9来自产脓链球菌，现在研究人员对它进行了改造，将编码Cas9蛋白的基因序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。研究人员只需针对需要编辑的DNA序列合成一段DNA序列，插入CRISPR-Cas9载体的特定部位，在转入宿主细胞后，人工构建的导向RNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，也就既能从基因上根治疾病，也可能从基因上操控生命。

3种基因剪刀的比较

CRISPR-Cas9系统现在显示出最神奇作用的是，它可以在DNA的分子水平根治疾病，治疗一系列人类尚不能征服的顽症，如艾滋病、疟疾。原因在于，CRISPR-Cas9系统比第一代基因编辑器锌指核酸酶（ZFN）系统和第二代基因编辑器转录激活因子样效应因子核酸酶（TALEN）系统有更多和更大的优点。

ZFN和TALEN都是嵌合体，都是由经过设计的、序列特异性的DNA结合元件和非特异性的DNA切割结构结合而成。ZFN和TALEN都可以对DNA进行各种切割和遗传修饰，其作用机制都是先对DNA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口，然后激活细胞内的非同源末端连接修复机制（是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制），或者激活同源重组修复机制（是一种高保真的修复机制，不容易出现突变），利用细胞自身的修复机制对DNA进行编辑和遗传修饰。

但是，ZFN和TALEN在基因序列的数百甚至上千个碱基中才能找到一个可作用的编辑位点，因而大大限制了它们的使用范围。但CRISPR-Cas9系统的可编辑位置更多，理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9系统进行编辑的位置，因此，这一技术能对任何一种基因进行编辑操作。

更重要的是，CRISPR-Cas9系统的安全性更强，因为它可以不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后非同源DNA末端连接造成的染色体变异风险，也即基因突变，从而精确地去除致病基因。

现在，对难以治愈的艾滋病和癌症就可以利用CRISPR-Cas9系统来治疗，因为这把基因剪刀可以剪掉隐藏在人体免疫细胞中的艾滋病病毒和去除引起癌症的病毒的基因。

根治艾滋病

美国艾滋病专家于2014年7月10日宣布，曾被认为“功能性治愈”的“密西西比婴儿”在停药两年多后体内再次检测出艾滋病病毒（HIV）。尽管专家还不清楚为何“密西西比婴儿”体内的HIV会复活，但是根据现有的研究表明，HIV会在人体的肠道等多种部位和组织中藏匿起来，并形成病毒储存库，进入休眠状态。一旦外部环境适宜，例如，没有药物的攻击和抑制，病毒休眠体就会源源不断地产生新的HIV。

对此，研究人员认为，利用CRISPR-Cas9系统可以精确清除隐藏在人体细胞中的1型艾滋病病毒（HIV-1是感染大部分人的艾滋病病毒）的基因，从而根治艾滋病。美国天普大学和中国四川大学华西医院的研究人员共同设计了一种长度为20个核苷酸的靶向RNA，能够引导到HIV-1的DNA，然后利用CRISPR-Cas9系统来根除HIV-1。

靶向RNA的目标是HIV-1的3’端和5’端长末端重复序列（LTR），LTR就位于HIV-1基因组两端。在靶向RNA到达HIV-1两端的LTR后，Cas9蛋白就可以剪去HIV-1基因组的9709个核苷酸（核心基因）。同时，为了避免靶向RNA伤及患者自身细胞的基因组，研究人员挑选了人类DNA编码序列中不会出现的核苷酸序列，以避免CRISPR-Cas9系统脱靶和损伤自身的DNA。

人体被感染细胞中的HIV-1的一些核心基因后，HIV就不能在人体细胞中藏匿和复制了，同时人体细胞中的基因会自动修复和复制，把细胞DNA中被切割的那部分修复好，恢复成无HIV的细胞。

现在，这种基因组编辑清除HIV-1的效果在几种感染了HIV-1的细胞类型中得到验证，包括小胶质细胞、单核细胞、巨噬细胞和T细胞。T细胞和单核细胞是HIV-1感染人体的主要的细胞类型，因此，清除这些细胞中的HIV-1基因也就能彻底根治艾滋病。

利用CRISPR-Cas9系统清除人体细胞中隐藏的HIV是永久性治愈艾滋病的方法，当然，这种疗法目前不仅复杂和费用高昂，而且还需要进行安全性的试验。因此，还需要一些时间才能成熟起来。

治疗癌症

癌症的产生有多种原因，其中之一是病毒感染导致癌症，例如宫颈癌。现在，研究人员能明确的是，人乳头瘤病毒（HPV）能导致宫颈癌、头颈癌和其他癌症，而且这种病毒引起了几乎所有的宫颈癌和大约一半的头颈癌。因此，可以通过CRISPR-Cas9系统删除人乳头瘤病毒的部分关键基因而使其失去致病性，从而预防和治疗宫颈癌。

美国杜克大学医学院的分子遗传学教授卡伦等人利用CRISPR-Cas9系统选择性地切除两个导致宫颈癌细胞生长和存在的病毒基因，从而使癌细胞自我毁灭，根治宫颈癌。

根据CRISPR-Cas9系统的作用原理，Cas9这种DNA切割酶能够与靶向RNA结合，靶向RNA则能够告诉Cas9切割哪一部分基因。因此，卡伦等人以诱发宫颈癌的人乳头瘤病毒的两个致癌基因E6和E7为目标，生成了靶向RNA，然后再添加Cas9蛋白，成为一个CRISPR-Cas9系统混合物（抗病毒的基因工程混合物）。

随后，研究人员把这种以E6和E7基因为目标的CRISPR-Cas9系统在实验室培养皿中感染宫颈癌细胞，结果发现，这种靶向CRISPR-Cas9系统让癌细胞立即停止生长。作为对照，用随机靶向RNA制成的CRISPR-Cas9系统感染宫颈癌细胞并未阻止癌细胞生长。

进一步的分子水平的探索表明，以E6、E7基因为靶向的CRISPR-Cas9系统切除E6和E7基因后，可以促进p53蛋白的功能，p53被称为基因组的守护者，当它感觉到哪里出现问题时，可以打开细胞中的自杀通路。当CRISPR-Cas9系统靶定E6和E7并清除它们时，就可以让p53恢复其正常功能，促进肿瘤细胞的死亡（凋亡）。

根据同样的原理，美国麻省理工学院的杰克斯等人瞄准肺腺癌（占所有肺癌的40%）的致癌基因Kras，制作成特异性的CRISPR-Cas9系统，同样抑制了肿瘤的生长。

【责任编辑】张田勘