溶菌酶及其在食品工业中的应用*

范林林，林楠，冯叙桥，王晶晶，杨文晶，许泰百

1(渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州，121013)2(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳，110866)3(辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州，121001)

溶菌酶(lysozyme，EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，因其具有溶菌(细菌、真菌)作用，故命名为溶菌酶。溶菌酶能够破坏微生物细胞壁的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键，分解不溶性黏多糖为可溶性糖肽，所以又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶［1］。除此之外，还可与带负电荷的病毒蛋白结合，与脱辅基蛋白、DNA、RNA合成复盐，使病毒失活。溶菌酶来源较为广泛，除可从动物、植物及微生物中获得，已有较多基因工程重组溶菌酶(DNA重组)的报道。根据来源不同，可将其分为植物溶菌酶、动物溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌体溶菌酶，其中动物溶菌酶又可分为C型(鸡蛋清溶菌酶)、G型(鹅蛋清溶菌酶)和I型(无脊椎动物溶菌酶)［2］。

1992年FAO/WTO的食品添加剂协会公布:溶菌酶应用于食品工业中是安全的，我国卫生部2010年第23号公告批准溶菌酶等物质为食品添加剂。在食品中，溶菌酶可选择性地使目标微生物细胞壁溶解，致使内容物流出，从而使其失去生理活性，可以安全替代对人体健康有害的化学防腐剂，是一种无毒副作用的天然保鲜剂、安全绿色的添加剂［3］。其中，在食品工业中主要应用于水产品、乳制品、果蔬、肉类、酒及饮料的防腐保鲜，不同来源的溶菌酶的最适作用条件各不相同，因此了解溶菌酶酶学性质对减少其在食品工业应用中的损失具有较大意义。本文综述了溶菌酶的酶学性质及其在食品工业各个领域中的应用，以期为溶菌酶在食品工业中的应用提供重要的基础参考。

1 溶菌酶的分离纯化与改性

1.1 溶菌酶的分离纯化方法

为了达到良好的分离效果，必须根据来源的不同，选择适宜的分离方法。同时，单一的分离纯化方法一般无法满足回收率和纯度的要求，应将两种或者几种方法联合使用，按照一定的顺序进行分离，或者建立连续式的分离体系。由于溶菌酶来源众多，其分离纯化也有超滤法、亲和色谱法、离子交换法和直接结晶法等多种方法(表1)。随着新的生物分离技术的出现，反胶团萃取、染料亲和色谱、双水相萃取、亲和膜色谱、亲和沉淀等分离纯化方法也被采用［4］。结晶法是普遍采用的方法，其中膜结晶受到越来越多的关注，膜结晶具有结晶诱导时间短、结晶过程可控、蛋白质初始浓度低等优点。

鸡蛋清中溶菌酶的含量较高，因此目前国内外主要从中提取溶菌酶。傅冰等人采用二次硫酸铵沉淀和离子交换层析透过法分离溶菌酶，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度，研究鸡蛋清中溶菌酶的分离提取工艺，酶活提高超过15倍，回收率为15.76%，是目前一种高效的提取方法［5］。

1.2 溶菌酶作为天然生物防腐剂的改性研究

天然溶菌酶主要作用于革兰氏阳性细菌，而对革兰氏阴性菌效果不明显，原因是革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量很少，并被脂多糖类物质包裹［6］。为了实现溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑制作用，需对天然溶菌酶进行改性。

表1 溶菌酶的分离纯化方法Table 1 Methods of separation and purification of lysozyme

溶菌酶的改性常通过化学修饰或热改性的方法来探索和实现，如果所使用的化学修饰剂是非食品级的，则存在安全隐患;热改性后的溶菌酶可能存在对革兰氏阳性菌的作用降低的问题［12］。因此研究学者常采用超高压处理，通过不同的温度、压力、施压方式和保压时间改变天然溶菌酶的结构，由表2可知，超高压能拓宽溶菌酶的抗菌谱，避免了化学修饰和热改性的缺点［8］。溶菌酶经生物改性后，其抑菌活性增强，扩大了溶菌酶的作用范围(表2)。

表2 天然生物防腐剂溶菌酶的改性研究［6］Table 2 Research progress on modification of lysozyme as natural biological preservative［6］

2 溶菌酶在食品工业中的应用

在食品工业中，溶菌酶作为一种无毒、无副作用、安全性高的天然蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，并且对食品中的其他营养成分影响很小，因此成为食品防腐剂和营养保健品的优选对象。溶菌酶的杀菌属于冷杀菌，可避免高温杀菌对食品营养和风味的破坏作用，尤其对热敏感的食品更具有重要意义。

2.1 用于水产类制品的保鲜和防腐

因溶菌酶具有杀菌、抑菌的作用，近年来，很多研究学者研究了溶菌酶对水产品的防腐保鲜效果，并且取得了良好的成果。表3列举了溶菌酶在不同水产品中防腐保鲜的应用实例，除此之外，溶菌酶还可作为鱼丸等水产熟制品的保鲜剂，将一定浓度的溶菌酶溶液喷洒在产品上，可起到防腐保鲜的作用;一些新鲜水产品(虾、蛤蜊肉等)在0.05%的溶酶菌溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行低温贮藏，均可延长贮存期［7］。

表3 溶菌酶在水产品中的若干应用实例Table 3 Several application examples of in fresh-keeping of aquatics

2.2 在乳制品中的应用

溶菌酶是一种非特异性免疫因子，人乳中溶菌酶的含量约是牛乳中的3 000倍，将溶菌酶添加到乳粉中，使牛乳人乳化。据报道，溶菌酶对肠道中腐败性微生物有杀灭作用，能促进婴儿肠道内双歧杆菌的增殖，促进人工喂养婴儿肠道菌群的正常化，还能增强机体对感染的抵抗力，对早产婴儿有预防消化器官疾病、体重减轻的作用，是配方奶粉及婴儿食品等的良好食品添加剂。

向乳制品特别是巴氏杀菌奶中添加溶菌酶，能有效延长其保存期，一般在包装前加入300～600 μg/mL;另外，由于溶菌酶具有一定的耐高温性，因而也可被用于高温瞬间杀菌奶中。郭庆启等［13］人报道了溶菌酶经固定化后耐热性提高、耐酸性增强;固定化后的溶菌酶与底物壳聚糖的亲和力下降，重复使用5次时，酶活力残留率为57.6%。在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的起泡、风味变差，并且对奶酪老化过程中奶酪基液的品质不造成影响，同时还能起到较好的抑菌作用，不至引起酪酸发酵，有效防止由于丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium tyrobutyricum)污染发酵奶酪中的乳酸盐而产气或“后期的开裂”现象。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。溶菌酶还可作为防腐剂用于蛋糕、奶油等极易腐败变质的食品中。据报道转基因羊能够产生富含溶菌酶的奶，溶菌酶含量可达到270mg/L，占人乳的67%。

2.3 在肉制品中的应用

溶菌酶与EDTA联合应用在火腿、腊肠及其他肉制品等中，已取得了较好的协同保鲜效果。溶菌酶对于控制冷鲜肉的细菌总数的增殖、减缓TVB-N值的上升方面也具有明显效果，GNa液、Nisin、溶菌酶三者配合处理冷鲜肉，取得了非常理想的保鲜效果［14］;张杰等［15］人研究表明，0.75 g/L乳酸链球菌肽、1.0 g/L溶菌酶及2.0 g/L壳聚糖保鲜剂结合真空包装对兔肉的保鲜效果较好，可使其在0～4℃冷藏条件下保鲜期达至27 d。Huang等［16］人研究了溶菌酶、壳聚糖及有机累托石复合涂膜对猪肉保鲜效果的影响，结果表明，能够有效抑制大肠杆菌和黄色葡萄球菌的生长繁殖，保存猪肉至21 d左右。

2.4 在果蔬产品中的应用

近年来，溶菌酶也广泛应用于果蔬的防腐保鲜中，并且起到了良好的保鲜效果。表4列举了近几年溶菌酶及溶菌酶与其他物质配伍应用于果蔬保鲜中的若干实例。除此之外，溶菌酶对豆豉和四川泡菜等热敏感的发酵食品具有防腐抑菌作用，可有效地抑制发酵食品发生褐变，维持原有色泽，还可极明显地减少食盐用量，降低泡菜和豆瓣的咸味，提高产品风味，同时避免了高温杀菌对这类食品风味的破坏作用。此外，Kerkaert等［17］人使用溶菌酶作为一种蛋白质的指示剂，来检测鲜切蔬菜中过敏蛋白质的行为。

表4 溶菌酶在果蔬贮藏中的若干应用实例Table 4 Several application examples of in fresh-keeping of fruit and vegetables

2.5 在保健功能性食品中的应用

溶菌酶具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血，促进组织再生和瘢痕形成等作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。研究报道了在饲养肉鸡中用溶菌酶代替氧氟沙星、磺胺类、氟苯尼考等化学保健品，结果表明，溶菌酶组出栏用药成本、鸡群总重和死亡率等均显示较好效果。此外，医学上，若在牙膏、漱口水、口腔清洁剂、口香糖中设法添加一定量的溶菌酶，可以杀死导致蛀牙的病菌，达到预防虫牙的目的。

2.6 在食品包装材料中的应用

目前有关溶菌酶在包装材料上应用的理论研究较多，即将溶菌酶固定在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品包装材料，延长食品货架期。目前许多肉制品软包装都要进行高温灭菌处理，经此处理后的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味，影响消费量;如果在肉制品真空包装前添加一定量的溶菌酶(1%～3%)，然后巴氏杀菌(80～100 ℃，25～30 min)，可获得很好的保鲜效果，避免了高温灭菌带来的负面影响。同样，果蔬加工前添加一定量的溶菌酶，一般添加量为0.1% ～0.2%(拌料时添加)或1% ～3%(加热煮制时添加)，也能起到很好的保鲜效果。Gemili等［23］人研究了溶菌酶固定在醋酸纤维酯包装材料上，能够有效维持溶菌酶的活性，提高溶菌酶的抗菌活性。Corradini等［24］人报道了溶菌酶结合溶胶技术制成抗菌膜，研究了其抗菌活性，结果表明了该处理能够有效地抑制微生物的生长繁殖。杜会云等［25］人证实了添加壳聚糖、溶菌酶和牛至油的大豆分离蛋白膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉等微生物均有显著的抑制作用。用蛋清溶菌酶配制的2%～3%酶液，喷洒于包装纸上或浸入酶液(2～3 h)，烘干，包装煮熟的大豆、馒头，贮藏1周不变味，而用普通纸包装的这些食品贮藏1 d就会发黏变味。

2.7 溶菌酶的其他作用

溶菌酶是低度酒的理想防腐剂，可防止低度酒中酸菌的繁殖生长，不影响酒的风味，溶菌酶已应用于纯生啤酒中［26］;溶菌酶还可应用于饮料(pH 6.0～7.5)的防腐，果汁和料酒中也有应用。在生面条、花生酱和色拉等食品中加入溶菌酶，也可起到良好的保鲜效果。溶菌酶在家禽饲料中使用，可降低发病率，能提高血清中溶菌酶含量和免疫功能。溶菌酶固定在空气过滤器上，可作为空调的空气净化系统，使其具有高效除尘、杀菌两大功能。溶菌酶在化妆品中也应用。

利用溶菌酶处理革兰比阳性细菌还可得到原生质体，因此，溶菌酶也是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。溶菌酶与免疫球蛋白的功能紧密联系，可进入机体增强抗体活性，从而杀灭有害微生物，溶菌酶对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒都具有较强的抑制作用。用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖，使其成为能被人体吸收的、低分子质量的、有独特的生理活性和功能性质的低聚壳聚糖。因此，开发溶菌酶具有良好的经济价值。

3 溶菌酶与其他技术结合的应用研究

随着食品工业的快速发展，各种高效、安全的食品保鲜技术层出不穷。将溶菌酶与其他保鲜技术结合，能够使食品在加工和贮藏时取得良好的防腐保鲜效果。

3.1 溶菌酶与辐照保鲜技术

食品辐照保鲜已被证明是一种高效、安全的加工手段。水产品腐败菌中大部分是革兰氏阴性菌，该菌对射线较为敏感，国外关于冰鲜鱼的辐照保鲜研究得出，辐照剂量为1kGy即可起到很好的保鲜作用［27］。较低温度时辐照出口冷冻虾仁，可降低辐照剂量，且保鲜效果较好。因此，将溶菌酶、辐照及与低温协同保鲜可以进行尝试研究，且辐照对溶菌酶抑菌活性是否有促进或是抑制作用可成为研究重点。

3.2 溶菌酶与高压超声波处理技术

Gomez等［28］研究发现，在 300 MPa 的水压下，冷冻烟熏鲯鳅肉片的感官品质是最佳的，且减少贮藏前期微生物的含量。据Nakimbugwe［29］等报道:在相同的超高压处理下，溶菌酶为食品防腐提供了另一个屏障。食品经过超高压超声波(manosonication，MS)双道处理，可提高枯草芽孢杆菌的芽孢对溶菌酶的敏感性，并且推断超声波处理可以破坏芽孢外层，降低其耐热性。

3.3 溶菌酶与气调包装技术

气调包装(MAP)技术是目前流行的一种无防腐剂或低防腐剂量的包装技术。Fernandez等［12］将溶菌酶与气调包装结合，能使大西洋鲑鱼片的货架期延长，其保鲜效果优于单一的溶菌酶处理组。谢晶等［30］人将复合生物保鲜剂(1.0%壳聚糖+0.4%茶多酚)结合气调包装，处理带鱼，既延长了货架期，又能较好维持感官品质，取得了良好的保鲜效果。溶菌酶结合高压CO2可使酸土脂环酸杆菌芽孢核心物质2，6-吡啶二羧酸(DPA)发生大量泄露，且部分芽孢完全破裂，因此溶菌酶与高压CO2杀灭芽孢的协同效果较好［31］。

4 溶菌酶应用中所存在的问题

目前我国提取的溶菌酶的纯度和活性远不如国外的，溶菌酶提取技术需要深入研究。溶菌酶的高端产品主要被美国、加拿大等国公司垄断，我国只能作为粗品原料出口，而且高端产品还要依赖进口，这些事实严重阻碍了我国溶菌酶产业的发展。一些学者通过物理、化学或生物的方法对溶菌酶进行改性研究，以期获得对G－菌较好的抑制或灭菌效果。溶菌酶经化学改性后，酶的空间构象会发生变化，但是尚不能准确解释其结构和功能的关系此外，如果所使用的化学修饰剂属非食品级，则化学修饰后的溶菌酶在食品领域使用的安全性，有待进一步研究证明。

另外，溶菌酶作为酶类生物保鲜剂，需在适宜的温度、pH、水分等条件下，才能发挥较大的活性。而一些水产品及肉产品生产过程中一般会有高温杀菌工序;且一般进行低温保藏，这两种操作极有可能使得溶菌酶的抑菌效果较差。热变性的溶菌酶，虽然丧失了酶活，但仍可对多种细菌和真菌表现出抗菌活性，例如T4溶菌酶，溶菌酶的抑菌活性与酶活之间的关系有待考究。此外，溶菌酶具有专一性，单一使用溶菌酶对酵母、霉菌引起的腐败变质不能起到很好的保鲜作用，应使用复合生物保鲜剂。溶菌酶对动物肠道菌群的影响缺乏具体的研究报道，影响了其作为营养功能食品添加剂的推广应用。不同来源的溶菌酶对产品的保鲜效果是否具有协同作用等也需进一步考究。

5 展望

随着产品市场竞争的日趋激烈，发展绿色、安全、优质、高效的产品将是食品工业发展的必然趋势，其中溶菌酶满足了这一需求，目前，有关溶菌酶的研究热点是除了杀菌功能以外的其他未知生物学作用，其次是有关人溶菌酶的应用研究。人溶菌酶通常是从人乳或胎盘中少量提取，然而来源困难，提取方法复杂，因此不能进行大规模工业化生产，采用基因工程技术，从细菌或酵母中生产人溶菌酶是解决其供需矛盾的主要途径。人溶菌酶参与机体的防御机制，有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，具有潜在的临床应用价值，前景是可观的。通过基因工程途径生产溶菌酶可较大程度地降低成本，以推动其在医药业、食品工业、畜牧业等领域中的应用。

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