人乳头瘤病毒阳性阴道分泌物蛋白指纹图谱初步研究

姜 伟 解春宝 杜 琼 黄文芳 杨永长 肖代雯

人乳头瘤病毒阳性阴道分泌物蛋白指纹图谱初步研究

姜 伟 解春宝 杜 琼 黄文芳 杨永长 肖代雯

目的 对比分析人乳头瘤病毒(HPV)阳性和阴性阴道分泌物蛋白指纹图谱, 探索HPV阳性阴道分泌物是否存在特定蛋白标志。方法 运用蛋白指纹图谱(PBSⅡ-C型)技术及金芯片检测45例HPV阳性患者和44例HPV阴性对照者阴道分泌物蛋白指纹图谱, 分析HPV阳性阴道分泌物特定表达的蛋白标志, 筛选其中部分差异蛋白建立HPV测试模型并评价其检测效能。结果 HPV阳性和阴性对照者间共检测到41个蛋白峰, 其中17个蛋白峰的差异有统计学意义(P＜0.05)。筛选其中5个标志蛋白建立的模型对HPV的检测灵敏度和特异度分别为96.0%(24/25)和95.8%(23/24)。结论 蛋白指纹图谱技术能有效检测阴道分泌物特定表达的蛋白, 筛选的差异蛋白对诊断HPV感染具有潜在应用价值。

蛋白指纹；金芯片；人乳头瘤病毒；阴道分泌物

前期研究结果显示, 大部分宫颈癌的发生均与HPV的感染有关［1］。在宫颈癌发生前, 及时明确HPV感染的存在和感染所致癌前病变, 对于疾病的诊断、治疗及预后都具有重要价值。目前实验室检测HPV感染的方法包括杂交捕获法(HC-Ⅱ法)、聚合酶链反应(PCR)检测法、基因芯片法等,但鲜见利用蛋白指纹图谱技术检测HPV方面的研究报道［2,3］。本研究采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDITOF-MS)技术, 比对分析HPV阳性和阴性阴道分泌物蛋白指纹图谱差异性, 探索HPV阳性患者阴道分泌物中特定表达的蛋白标志。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 阴道分泌物样本来自于2014年1～12月四川省医学科学院.四川省人民医院妇科和皮肤科患者：HPV阳性样本45例, 患者年龄27～45岁, 平均年龄(33±7)岁；HPV阴性对照样本44例, 患者年龄25～48岁, 平均年龄(31±8)岁。阴道分泌物HPV感染通过DNA定量检测判定,检测方法采用实时荧光定量PCR法。利用Excel 2013软件(美国微软公司)将样本随机抽样分为训练组和验证组：训练组包括HPV阳性样本和阴性对照样本, 各20例, 用于建立HPV检测模型；剩余49例样本归为验证组, 用于盲法验证测试模型的效能。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量PCR仪(7500型)购自美国ABI公司；PBSⅡ-C型蛋白指纹图谱仪(SELDI-TOF-MS)、金芯片(Proteinchip golden array)购自美国Bio-Rad公司；丙酮、 Insulin、Cytochrome C、Myoglobin、芥子酸(SPA)购自美国Sigma公司；离心机Microfuge 18 Centrifuge 购自美国贝克曼库尔特。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提纯 将收集好的阴道分泌物标本于4℃1500 r/min 低速离心 5 min, 然后取上清液 2 ml 与 8 ml 冷丙酮混合后放置过夜。将过夜标本 10000 r/min 离心 15 min, 弃去上清液。吸取 20 μl ddH2O 加入沉淀中混匀即为蛋白样品。

1.3.2 仪器校正 采用蛋白标准品 Insulin(MW 5733.49), Cytochrome C(MW 12230), Myoglobin(MW 16 9 50)对 SELDITOF-MS进行分子量校准和检测参数设置。

1.3.3 蛋白指纹图谱检测 取蛋白样品 5 μl与 5 μl 半饱和SPA混合后, 取 2 μl 加于金芯片的点样孔中, 室温干燥 15 min,每孔再加1 μl半饱和SPA, 自然干燥后采用PBSⅡ-C型蛋白芯片阅读仪进行检测。质量控制、数据采集和分析参照作者前期的研究［4］。

1.3.4 HPV检测模型 筛选差异表达的蛋白, 利用训练组样本的蛋白数据结合人工神经网络技术［5］建立阴道分泌物HPV检测模型并进行反复训练, 利用验证组的样本对模型进行盲法验证。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对研究数据进行统计分析。HPV阳性与HPV阴性对照阴道分泌物蛋白峰的比较以均数 ± 标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 蛋白表达差异性 利用蛋白指纹图谱技术检测HPV阳性与阴性对照阴道分泌物, 共得到41个蛋白峰, 其中17个蛋白峰的差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 HPV阳性患者与阴性对照者间阴道分泌物蛋白表达的差异( x-±s)

2.2 HPV检测模型 利用质荷比为3941、4698、10435、10989、11038的5个差异蛋白构建人工神经网络模型并反复训练, 盲法验证结果显示25例HPV阳性样本中出现1例判断错误, 而24例HPV阴性对照中也有1例误判。该模型对HPV检测的灵敏度为96.0% (24/25), 特异度为95.8%(23/24)。

3 讨论

前期大量的研究证明宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌的发生与HPV感染密切相关, 尤其是高危型HPV感染, 是子宫颈癌发生的主要病因［6,7］。蛋白指纹图谱技术是近几年发展起来的实验室诊断新技术, 具有操作简便、快速、高通量、灵敏性和特异性高等优点。该技术在医学领域中多用于疾病蛋白标志的检测和筛选, 如肿瘤蛋白标志的发现, 尤其是筛选传统肿瘤标志物阴性的恶性肿瘤特定蛋白标志物。

近年来, 鲜见有利用临床蛋白质组学相关技术, 例如蛋白指纹图谱技术, 对HPV感染患者阴道分泌物的研究报道。作者的初步研究通过对比分析HPV感染患者和HPV阴性对照者阴道分泌物中蛋白表达的差异性, 筛选HPV阳性阴道分泌物的蛋白标志物, 并利用筛选的蛋白构建HPV检测模型,为临床HPV的早期、快速检测和鉴定提供了新的思路。研究结果显示HPV感染患者和HPV阴性对照者阴道分泌物间存在17个差异表达的蛋白峰。利用其中5个蛋白建立的测试模型对样本进行盲法预测, 得到了较高的HPV检测灵敏度和特异度。筛选的标志蛋白, 为开展蛋白分子水平的HPV感染研究奠定了基础, 并可进一步研究这些蛋白在宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌, 以及疾病不同发展阶段中的表达情况, 或许可为宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌发病机理及演进的研究,以及临床早期检测和治疗评价提供帮助。

本研究同样也存在一些缺陷：①蛋白指纹图谱技术平台相对较复杂且成本较高；②由于蛋白指纹检测的高灵敏性和操作步骤较多, 一定程度上影响了实验的重复性；③所需的样品来源对象中潜在的其他疾病状况可能会影响分析而产生错误的结果；④筛选的差异蛋白还需要进一步鉴定, 以确定蛋白的本质。

综上所述, 本研究证实了蛋白指纹图谱技术能够有效检测HPV阳性阴道分泌物中特定表达的蛋白标志。利用部分标志蛋白建立的检测模型对临床早期、快速诊断HPV感染具有潜在应用价值。同时, 筛选的差异蛋白为进一步从蛋白分子水平分析HPV感染与宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌相关性提供了数据, 因此值得进一步研究。

［1］ Aggarwal P.Cervical cancer: can it be prevented? World J Clin Oncol, 2014, 5(4):775-780.

［2］ Liu Y, Qian W, Zhang J, et al.The indicative function of Twist2 and E-cadherin in HPV oncogene-induced epithelial-mesenchymal transition of cervical cancer cells.Oncol Rep, 2015, 33(2):639-650.

［3］ Munkhdelger J, Kim G, Wang HY, et al.Performance of HPV E6/ E7 mRNA RT-qPCR for screening and diagnosis of cervical cancer with ThinPrep Pap test samples.Exp Mol Pathol, 2014, 97(2):279-284.

［4］ 姜伟, 杨永长, 肖代雯, 等.尿蛋白标志物模型早期诊断糖尿病肾病的临床应用 .中华检验医学杂志, 2009, 32(10):1101-1107.

［5］ 姜伟, 杨永长, 肖代雯, 等.基于Au蛋白芯片技术的狼疮肾炎患者尿蛋白标志物研究.中华风湿病学杂志, 2010, 14(4):244-247.

［6］ Li C, Ma C, Zhang W, et al.The immune function differences and high-risk human papillomavirus infection in the progress of cervical cancer.Eur J Gynaecol Oncol, 2014, 35(5):557-561.

［7］ de Freitas AC, Gomes Leitão Mda C, Coimbra EC.Prospects of molecularly-targeted therapies for cervical cancer treatment.Curr Drug Targets, 2015, 16(1):77-91.

Primary research of protein fingerprint in vaginal secretion with positive human papilloma virus

JIANG Wei, XIE Chun-bao, DU Qiong, et al.
Department of Inspection, Sichuan Province Academy of Medical Sciences/ Sichuan Province People’s Hospital, Chengdu 610072, China

Objective To compare and analyze protein fingerprint in vaginal secretion with positive and negative human papilloma virus (HPV), and to explore existence of specific protein marker for vaginal secretion with positive HPV.Methods Protein fingerprint (type PBSⅡ-C) and golden chip were applied in detection of protein fingerprint in vaginal secretion of 45 positive HPV cases and 44 HPV negative cases.Specific protein marker of vaginal secretion with positive HPV was analyzed, and differential protein was screened to establish HPV detection model and evaluate its effect.Results A total of 41 protein peaks were detected in positive and negative HPV cases, and 17 protein peaks among them had statistically significant difference (P＜0.05).Sensitivity and specificity of 5 models established by protein markers in detection of HPV were respectively 96.0% (24/25) and 95.8% (23/24).Conclusion Protein fingerprint can provide effective detection of specific protein expressionin vaginal secretion, and the screened differential protein contains potential application value in diagnosis of HPV infection.

Protein fingerprint; Golden chip; Human papilloma virus; Vaginal secretion

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.22.005

2015-05-11］

610072 四川省医学科学院·四川省人民医院检验科通讯作者：姜伟