鹿茸和大豆蛋白酶解物3ku超滤组分的制备及其对小鼠脾细胞增殖影响的研究

赵 磊，王 旋,谢峤菲,李思然,吴 迪,倪昌征

(北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心,食品质量与安全北京实验室,北京 100048)

鹿茸和大豆蛋白酶解物3ku超滤组分的制备及其对小鼠脾细胞增殖影响的研究

赵 磊，王 旋,谢峤菲,李思然,吴 迪,倪昌征

(北京工商大学北京市食品添加剂工程技术研究中心,食品质量与安全北京实验室,北京 100048)

以鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白为原料,采用模拟胃肠消化和碱性蛋白酶水解,根据游离氨基含量变化优化水解时间,制备鹿茸蛋白和大豆分离蛋白酶解物。通过超滤分离获得各酶解物分子量<3ku的组分:鹿茸蛋白模拟胃肠消化物组分(VAWP-SGD)、鹿茸蛋白碱性蛋白酶解物组分(VAWP-APH)、大豆分离蛋白模拟胃肠消化物组分(SPI-SGD)、大豆分离蛋白碱性蛋白酶解物组分(SPI-APH),探究各组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明:模拟胃肠消化时间为胃蛋白酶2h+胰酶5h;碱性蛋白酶水解时间4h。在无诱导剂时,VAWP-SGD和SPI-SGD对小鼠脾细胞增殖均有显著促进作用(≥100μg/mL)。VAWP-SGD对ConA诱导的小鼠脾T细胞增殖促进作用最显著,其次是VAWP-APH,SPI-APH无明显作用,SPI-SGD对脾细胞增殖有轻微抑制作用。VAWP-SGD对LPS诱导的小鼠脾B细胞增殖促进作用最强,其次是VAWP-APH,SPI-APH及SPI-SGD。综上,VAWP-SGD对小鼠脾细胞增殖影响最大,对进一步开发鹿茸产品和免疫活性肽具有重要意义。

鹿茸水溶性蛋白,大豆分离蛋白,体外模拟胃肠消化,碱性蛋白酶,小鼠脾细胞

亚健康状态越来越引起人们的关注,其表现多种多样,最本质、最核心的问题是人体自身免疫功能失调[1]。通过免疫调节改善自身免疫状况,是人们远离亚健康的最理想方法。免疫活性肽因其安全、易吸收、用量少、生物活性高的优势越来越具有研究及市场价值,其可通过促进免疫细胞增殖、提高巨噬细胞活性、促进细胞因子生成等[2-3]来提高机体免疫力。鹿茸作为中华养生五大圣品之一,其蛋白含量丰富,占干重的52%以上[4]。近年来研究发现鹿茸蛋白具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、治疗神经损伤等多种生物学效应[5-8],但就鹿茸蛋白被分解成何种小分子肽从而发挥功能活性仍未见报道。大豆肽有降低血清胆固醇、降血压、增加免疫和促进脂肪代谢等多种生物活性[9-10]。有研究发现蕴藏于蛋白质多肽链中的肽类物质的生理活性往往更强于其母体蛋白[11],为了更高效的利用鹿茸水溶性蛋白和大豆蛋白挖掘免疫活性肽,对鹿茸水溶性蛋白和大豆蛋白不同酶解物的免疫调节活性的研究显得尤为重要。

本研究确定了制备鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白模拟胃肠消化物及碱性蛋白酶解物的最佳水解时间,研究了这几种蛋白酶解物中分子量<3ku肽段对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,对其免疫调节作用进行初步评价。旨在探讨和比较不同来源和不同蛋白酶作用获得多肽的免疫调节活性,为利用鹿茸和大豆制备免疫活性肽提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜马鹿茸 由大兴安岭区科技局提供;大豆分离蛋白 北京奥博星生物技术有限公司;SPF级Balb/c小鼠(合格证号:SCXK(京)2012-0001),6～8周龄,雌性 北京维通利华实验动物技术有限公司;胃蛋白酶,胰酶 美国Sigma化学公司;碱性蛋白酶 丹麦诺维信公司;刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS) 美国MP Biomedical公司;RPMI-1640高糖培养基 美国Gibico公司;青链霉素混合液、红细胞裂解液、CCK-8试剂盒、Hepes 碧云天生物技术研究所;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;5、10ku超滤膜包 美国Millipore公司;3ku超滤离心管 德国Sartorius公司;其他试剂均为国产分析纯。

FD-1B-80型冷冻干燥机 南京普森仪器;TGL-10C型高速台式离心机 上海智城分析仪器制造有限公司;WE-1水浴恒温振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司;UV-2450型紫外可见光分光光度计 日本岛津;XX80EL005可调速超滤仪 美国Millipore公司;Axiovert 200型倒置显微镜 德国Zeiss公司;Eclipse Ci-L荧光显微镜 日本Nikon公司;Galaxy S型CO2培养箱 英国RS Biotech公司;SpectraMax i3型多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鹿茸水溶性蛋白的制备 取新鲜马鹿茸经冷冻干燥后低温粉碎制成鹿茸粉末。采用文献[12]报道方法提取鹿茸水溶性蛋白,经梯度盐析、透析、冷冻干燥得蛋白冻干粉,经计算水溶性蛋白得率为25.5%。蛋白冻干粉于-20℃保存备用。

1.2.2 不同蛋白酶解物的制备和分离 根据酶解过程中游离氨基含量变化优化酶解时间,确定反应条件后制备不同蛋白酶解物。

1.2.2.1 模拟胃肠消化蛋白时间的确定 在底物蛋白浓度为25mg/mL、胃蛋白酶4%(w/v)、pH1.5条件下反应3h,之后添加胰酶4%(w/v)、pH7.0条件下继续水解8h。每小时取样测游离氨基含量变化优化酶解时间。

1.2.2.2 碱性蛋白酶水解蛋白时间的确定 在底物蛋白浓度为30mg/mL、碱性蛋白酶质量分数为2%、pH9.5条件下水解10h。每小时取样检测游离氨基含量变化优化酶解时间。

1.2.2.3 游离氨基含量的测定 采用茚三酮法[13]测定不同蛋白酶解物中的游离氨基含量。以亮氨酸Leu为标准品绘制标准曲线,标准方程为y=3.7459x+0.022,R2=0.9933。利用标准曲线方程计算酶解液中-NH2含量(mmol/g)。

1.2.2.4 蛋白酶解物的分离 选用截留分子量为10、5ku的超滤膜包和3ku的超滤离心管将蛋白酶解物超滤,获得各组分经冷冻干燥后4℃保存备用。

1.2.3 脾淋巴细胞增殖实验

1.2.3.1 小鼠脾细胞悬液的制备 参考文献[14]，将Balb/c小鼠拉颈处死,无菌分离完整脾脏,用PBS冲去浮血,剥除结缔组织及脂肪成分。将脾脏置于小烧杯上的200目不锈钢滤网上,剪碎并用注射器针芯研磨。用PBS液洗涤,用吸管收集细胞液至离心管,1000r/min离心5min,弃上清液,加入3mL红细胞裂解液,静置2min,加入10mL PBS终止反应,1200r/min离心5min,弃上清液。用PBS液洗两次,不完全RPMI-1640洗一次,加适量RPMI-1640完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mmol/L Hepes)重悬细胞。调整浓度至2×106个细胞/mL。

1.2.3.2 脾淋巴T细胞增殖实验 将上述脾细胞悬液按100μL/孔加入到96孔培养板中,正常对照组为脾细胞悬液,ConA对照组为含有ConA(终浓度为5μg/mL)的脾细胞悬液,样品对照组为含有不同浓度样品的脾细胞悬液,样品组为含有含有ConA(终浓度为5μg/mL)和不同浓度样品的脾细胞悬液;随后用PBS补足使各组终体积为120μL。每个处理设6个复孔,然后将培养板置于37℃、5% CO2的培养箱中培养72h。

1.2.3.3 脾淋巴B细胞增殖实验 方法同1.2.3.2,将诱导剂ConA换作LPS(终浓度为10μg/mL)。

1.2.3.4 细胞增殖程度的测定及计算分析 本实验选用CCK-8试剂盒测定细胞增殖程度。结果用刺激指数(Simulation index,SI)表示,公式如下:

1.2.4 统计分析 每个实验重复6次,数据采用SPSS18.0软件分析,结果以均值±标准偏差(Mean±SD)表示,组间数据比较用单因素方差分析,p<0.05表示差异显著,p<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1.1 模拟胃肠消化过程中游离氨基含量变化 蛋白质在消化过程中被蛋白酶作用分解成不同分子量的肽段和氨基酸,随时间的延长酶解产物分子量变小,蛋白酶作用位点逐渐减少,酶解体系成分趋于稳定游离氨基含量不再变化。鹿茸蛋白和大豆分离蛋白在模拟胃肠消化过程中游离氨基含量变化如图1所示。由图可知游离氨基含量在胃蛋白酶作用下变化较小,进入胰酶作用阶段迅速增加随时间延长趋于稳定,两种蛋白在消化过程中游离氨基含量的变化趋势相似。鹿茸水溶性蛋白游离氨基含量的变化在胃消化2h后达到稳定状态,且含量增加较少。而在进入肠消化阶段的1h内迅速由(0.91±0.05)mmol/g增加至(1.71±0.02)mmol/g。继续肠消化游离氨基含量持续增加,在消化5h后达到最大值(2.63±0.04)mmol/g,之后游离氨基含量保持稳定。大豆分离蛋白在胃消化2h后游离氨基含量达到稳定值(0.79±0.02)mmol/g,进入肠消化阶段游离氨基含量迅速增加,在消化5h后达到最大值(3.83±0.05)mmol/g,之后再无显著变化。游离氨基含量达到稳定值,则蛋白水解充分酶解体系成分趋于稳定,由此确定鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白模拟胃肠消化的时间为胃蛋白酶2h+胰酶5h。

图1 模拟胃肠消化过程中鹿茸水溶性蛋白 和大豆分离蛋白游离氨基含量的变化Fig.1 Changes in the content of α-NH2during simulated gastrointestinal digestion of VAWP and SPI

2.1.2 碱性蛋白酶水解过程中游离氨基含量变化 鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白在碱性蛋白酶酶解过程中游离氨基含量变化如图2所示。由图看出,两种蛋白游离氨基含量变化趋势相近,在酶解初期含量迅速增加,而随水解时间的延长趋于稳定。加入碱性蛋白酶1h后,鹿茸蛋白游离氨基含量显著提高(p<0.01)。反应3h后游离氨基含量达到最大值(0.84±0.01)mmol/g,比水解前提高了2.5倍,之后无显著变化,则鹿茸水溶性蛋白酶解完全时间为3h。大豆分离蛋白在酶解4h后游离氨基含量达到最大值(1.09±0.06)mmol/g,之后游离氨基含量保持稳定,由此推断大豆分离蛋白在酶解4h后水解充分,酶解物组成成分趋于稳定。为防止大量制备酶解物时蛋白水解不完全,两种蛋白均采用4h作为水解时间。

图2 碱性蛋白酶水解过程中鹿茸水溶性蛋白 和大豆分离蛋白游离氨基含量的变化Fig.2 Changes in the content of α-NH2during alkaline protease hydrolysis of VAWP and SPI

综合图1和图2可知,与碱性蛋白酶水解过程相比,鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白在模拟胃肠消化环境下游离氨基含量变化更大,水解度更高,由此推测酶解物中小分子量肽段所占百分比可能较高,而且小分子肽更易被吸收利用,此结果暗示着鹿茸蛋白和大豆蛋白的模拟胃肠消化物更易被吸收利用。

2.1.3 超滤分离不同蛋白酶解物 采用超滤技术分离制备分子量<3ku的组分,分别得到鹿茸蛋白模拟胃肠消化物组分(VAWP-SGD)、鹿茸蛋白碱性蛋白酶酶解物组分(VAWP-APH)、大豆分离蛋白模拟胃肠消化物组分(SPI-SGD)和大豆分离蛋白碱性蛋白酶酶解物组分(SPI-APH),各组分占总酶解物的百分比如表1所示。由表1看出,不同蛋白酶解物中分子量<3ku的组分百分含量不同,其中最高的是源自大豆分离蛋白模拟胃肠消化物的SPI-SGD,其次是鹿茸水溶性蛋白模拟胃肠消化物VAWP-SGD,而源自碱性蛋白酶解物的VAWP-APH和SPI-APH含量相对较低。显然,模拟胃肠消化物中分子量<3ku组分的百分含量比碱性蛋白酶水解物中<3ku组分含量高,这也与其游离氨基含量较高相统一。

表1 不同蛋白酶解物中分子量<3ku的组分含量Table 1 The contents of <3ku ultrafiltration fractions in different hydrolysates

2.2 不同蛋白酶解物分子量<3ku组分对小鼠脾细胞增殖的影响

本研究通过各蛋白酶解物<3ku肽段对小鼠体外脾细胞增殖的影响来评价其免疫调节作用。超滤所得分子量<3ku肽段对小鼠脾细胞增殖活性的影响如图3～图5所示。

由图3可知,当浓度≤1μg/mL时,VAWP-SGD、VAWP-APH、SPI-SGD和SPI-APH单独对小鼠脾细胞增殖的影响均不显著(p>0.05)。除VAWP-APH在浓度为10μg/mL时对脾细胞增殖有显著促进作用(p<0.05)外,两种碱性蛋白酶解物<3ku组分在研究浓度范围内无明显作用。在浓度≥100μg/mL时,VAWP-SGD和SPI-SGD对小鼠脾细胞增殖有显著促进作用,SI值最高分别达到1.16±0.10和1.16±0.01,与空白对照组相比增长了15.9%(p<0.05)和16.2%(p<0.05)。结果表明,同种蛋白酶作用下鹿茸蛋白源的<3ku组分和大豆蛋白源的<3ku组分对小鼠脾细胞增殖作用类似,其中模拟胃肠消化物组分均有明显促进作用。而同种蛋白由不同蛋白酶水解得到的酶解物<3ku组分对小鼠脾细胞增殖影响有显著差异,其中模拟胃肠消化物分离组分有更明显的促进作用。这可能是因为不同来源的蛋白氨基酸组成有显著差异,且因蛋白酶对肽键的水解专一性,得到了组成和结构迥异的酶解物,从而对细胞增殖产生不同的影响。

图3 不同蛋白酶解物分子量<3ku组分 对小鼠脾细胞增殖的影响Fig.3 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on the proliferation of murine splenocytes注:*p<0.05,**p<0.01(与对照组比较),图4、图5同。

由图4可知,在浓度为0.5～200μg/mL范围内VAWP-SGD对ConA诱导的小鼠脾T淋巴细胞增殖有显著促进作用(p<0.05),其中在浓度为50μg/mL时SI值最高,比对照组增长了18.8%(p<0.01),之后继续增加样品浓度SI值开始降低,在400μg/mL时促进作用消失,导致这一结果的原因需进一步研究。VAWP-APH在≥50μg/mL时对脾细胞增殖呈明显促进作用,在浓度为100μg/mL时SI值达到最高,比对照组增长了12.3%(p<0.01)。SPI-APH对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖无显著影响,而SPI-SGD对ConA诱导的脾细胞增殖呈轻微抑制作用,在浓度为100μg/mL时SI值降低最高达12.0%。ConA是T淋巴细胞的有丝分裂原,可促进T淋巴细胞活化,进而使细胞因子合成、细胞因子受体表达、细胞分化及细胞增殖等变化。机体内T淋巴细胞的数量越大,增殖活性越高,机体由T淋巴细胞介导的细胞免疫功能越强[15]。本研究中VAWP-SGD和VAWP-APH对小鼠脾T细胞增殖在不同程度上均有促进作用,表示其具有免疫调节活性促进细胞免疫应答,其中VAWP-SGD作用更明显。而SPI-SGD对ConA诱导的脾细胞增殖呈抑制作用,发生该现象的机理有待进一步探讨,可能是样品影响了细胞对ConA的敏感性或是样品预先结合了细胞上ConA的受体从而使其失去了刺激细胞的作用。

上文例(1)这样的句子属于典型的叙事语体句，符合上面列出的要求；而在《骆驼祥子》中的另一段，则属于非典型的叙事语体句：

图4 不同蛋白酶解物分子量<3ku组分 对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖活性的影响Fig.4 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on ConA-stimulated proliferation of murine splenocytes

LPS是一种非胸腺依赖性抗原,不需要辅助性T淋巴细胞的作用,可直接刺激B淋巴细胞增殖分化为产生抗体的浆细胞,并分泌IgM等抗体,发挥体液免疫的功能[16]。图5表明,在浓度≥0.5μg/mL时,VAWP-SGD可显著促进小鼠脾淋巴B细胞增殖,在浓度为100μg/mL时SI值达到最高,比对照组增加17.2%(p<0.01)。而VAWP-APH呈现显著促进小鼠脾细胞增殖的作用,SI值最高增长11.40%(p<0.01)。SPI-SGD对小鼠脾淋巴B细胞的促进作用随浓度增大呈先增加后减小的趋势,在50μg/mL时SI最高达到1.648,增长了9.26%。SPI-APH在浓度为100～400μg/mL时显著促进细胞增殖(p<0.01),在100μg/mL时最高增长11.26%。由此可见,随样品浓度变化,几种<3ku的肽段组分对小鼠脾淋巴B细胞增殖均有促进作用,但作用趋势明显不同,其中VAWP-SGD促进作用最强,其次是VAWP-APH。

图5 不同蛋白酶解物分子量<3ku组分 对LPS诱导的小鼠脾细胞增殖活性的影响Fig.5 Effect of <3ku ultrafiltration fractions of different protein hydrolysates on LPS-stimulated proliferation of murine splenocytes

上述结果表明,不同蛋白酶解物<3ku组分对脾细胞增殖影响有显著差异。不同源蛋白的氨基酸组成差异可能是超滤所得肽段影响小鼠脾细胞增殖的主要因素之一。此外,蛋白酶种类也是重要影响因素。蛋白中含有许多生物活性序列,其中包括免疫活性肽,它以无活性的形式存在于蛋白前体物中,只有用适当的蛋白酶水解出来后,才能成为具有生理活性的肽段[17]。免疫活性肽通常含有碱性氨基酸[18],模拟胃肠消化中胃蛋白酶主要水解苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键促进水溶性蛋白质水解成为多肽,胰酶能够特异性地切断赖氨酸和精氨酸结合的位点产生富含碱性氨基酸的肽段,暴露出可能具有免疫调节活性的肽段。碱性蛋白酶作为一种非特异性内切酶主要作用于含疏水性羧基的肽键,可随机产生大量的小分子肽段,使蛋白质充分水解[19-22]。总的来说,鹿茸蛋白模拟胃肠消化物中<3ku组分对小鼠脾细胞增殖影响最大,其具有较显著的免疫调节活性,对继续开发鹿茸产品和免疫活性肽具有重要意义。

3 结论

本研究主要针对鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白,通过模拟胃肠消化和碱性蛋白酶水解获得不同蛋白酶解物,经超滤分离制备不同蛋白酶解物<3ku组分,采用脾细胞增殖实验探讨各组分免疫调节活性。结果表明,鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白模拟胃肠消化的时间为胃蛋白酶2h+胰酶5h,碱性蛋白酶水解时间为4h。经模拟胃肠消化的鹿茸水溶性蛋白和大豆分离蛋白游离氨基含量更高,水解度更大。经超滤分离所得分子量<3ku的各组分对小鼠脾细胞增殖影响差异显著。其中,鹿茸水溶性蛋白模拟胃肠消化物<3ku组分对未经诱导、ConA和LPS诱导的脾细胞增殖的促进作用最强,具有较强的免疫调节活性。此结果表明蛋白质来源和蛋白酶种类均对酶解物的免疫调节活性有一定影响,而蛋白质种类影响更大。本研究为进一步研究开发鹿茸产品和免疫活性肽提供理论和实验基础。鹿茸水溶性蛋白经模拟胃肠消化后释放出的生物活性肽的氨基酸组成、肽序及其作用机制仍然未知,可为下一步研究提供方向。

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Preparation of 3ku ultrafiltration fractions from velvet antler and soybean protein hydrolysates and their effect on murine splenocytes proliferation

ZHAO Lei,WANG Xuan,XIE Qiao-fei,LI Si-ran,WU Di,NI Chang-zheng

(Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Velvet antler water-soluble protein(VAWP)and soybean protein isolate(SPI)were hydrolyzed byinvitrosimulated gastrointestinal digestion and Alcalase to obtain different protein hydrolysates. The hydrolysis time was optimized according to the changes in the content of α-NH2. The<3ku fractions of velvet antler water-soluble protein simulated gastrointestinal digest(VAWP-SGD),velvet antler water-soluble protein Alcalase hydrolysate(VAWP-APH),soybean protein isolate simulated gastrointestinal digest(SPI-SGD)and soybean protein isolate Alcalase hydrolysate(SPI-APH)were fractionated by ultrafiltration. The effect of<3ku fractions on the proliferation of murine splenocytes were studied. Results indicated that the hydrolysis time ofinvitrosimulated gastrointestinal digestion were 2h with pepsin and 5h with pancreatin. The hydrolysis time by Alcalase was 4h. VAWP-SGD and SPI-SGD significantly promoted the proliferation of resting murine splenocytes(≥100μg/mL). VAWP-SGD showed the highest stimulated effect on ConA-stimulated murine splenocytes proliferation,followed by VAWP-APH. SPI-APH had no obvious effect on ConA-stimulated murine splenocytes proliferation,whereas SPI-SGD inhibited the proliferation of ConA-stimulated murine splenocytes. VAWP-SGD also had the strongest stimulated effect on LPS-stimulated murine splenocytes proliferation,followed by VAWP-APH,SPI-APH,and then was SPI-SGD. The above results showed that VAWP-SGD had the strongest stimulated effect on the proliferation of murine splenocytes,which suggested that VAWP-SGD was of great significance for the development of antler products and immune active peptide.

VAWP;SPI;invitrosimulated gastrointestinal digestion;Alcalase;murine splenocytes

2014-09-02

赵磊(1982-)，女，博士，副教授，主要从事功能性食品研究。

国家自然科学基金青年科学基金项目(31201324)；大学生科学研究与创业行动计划项目(SJ201402064)；北京市教育委员会科技计划面上项目(KM201210011008) 。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0342-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.061