黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物活性研究

杨秀芳， 王鹏飞， 马养民， 贾强强

(陕西科技大学 化学与化工学院 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室, 陕西 西安 710021)



黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物活性研究

杨秀芳， 王鹏飞， 马养民， 贾强强

(陕西科技大学 化学与化工学院 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室, 陕西 西安 710021)

采用96孔板倍半稀释法对黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物中分离纯化得到的11个化合物的抑菌活性进行研究，测定获得了化合物对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、尖孢镰孢菌、小麦赤霉病菌、苹果树腐烂病菌、番茄灰霉病菌的最小抑菌浓度(MIC).结果表明,黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物中9个化合物对细菌和真菌有不同程度的抑制作用，其中尿黑酸内酯、2,5-二羟基苯乙酸甲酯对测试菌均表现出良好的抑制作用，pyranonigrins A和asperpyrones A对细菌生长有较好的抑制作用，5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid对革兰氏阳性菌有较好的抑制作用，尿黑酸内酯、2,5-二羟基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A对部分细菌的MIC达到7.8μg/mL.并对分离得到的化合物尿黑酸内酯、2,5-二羟基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A、rubrofusarin B、asperpyrones A的抗氧化活性进行研究，采用DPPH法测定自由基清除率，结果表明尿黑酸内酯和2,5-二羟基苯乙酸甲酯具有良好的抗氧化性，抗氧化能力由强到弱顺序为尿黑酸内酯>2,5-二羟基苯乙酸甲酯>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B.从测试结果分析了化合物与抗氧化活性的构效关系.

内生真菌； 黑果枸杞； 代谢产物； 抑菌活性； 抗氧化性； 构效关系

0 引言

植物内生真菌是一种具有广泛的分布性、多样性的生物类群，可产种类繁多，结构新颖的次生代谢产物[1].研究表明，内生真菌在长期和宿主植物协同进化的过程中，能够产生与宿主植物相同或者类似的代谢产物[2]，利用药用植物内生真菌发酵生产药理成分既可以弥补资源短缺，又可以为寻找天然药物资源提供新的途径.

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)为茄科枸杞属植物[3]，是我国西北荒漠地区一种特有的野生植物资源，其浆果呈球形，成熟后为紫黑色，无毒，有甜味，是一种亟待开发的野生植物资源[4]，多生长于我国甘肃、西藏、青海、陕北等干旱盐碱地区[5]，其味甘、性平、清心热,用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症，属于传统藏药[6-8].现代医学GEJE也证明，黑果枸杞具有降低人体胆固醇、兴奋中枢神经、增强人体免疫力、防止各类癌症的功效[9].目前黑果枸杞研究多为果实花青素[10]、多糖[11]、色素[12]和黄酮[13]的提取及其抗氧化活性研究[14,15]，其内生真菌仅在本课题组开展研究.

鉴于药用植物内生真菌具有潜在的重要应用价值，课题组在前期研究中从黑果枸杞分离出81株内生真菌，其中有21株在高盐碱条件下分离得到，通过筛选发现活性菌株占76.19 %，高活性菌株占33.33 %[16].RER4在21株耐盐碱真菌中表现出高的抑菌活性，因此以RER4为目标菌株，对RER4菌株进行ITS序列测定，最终将RER4菌株鉴定为米曲霉(Aspergillusoryzae),Genbank登录号为KF198066.为全面了解菌株RER4所产生的其它次生代谢产物的类型，本文在对其发酵菌体化学成分研究的基础上，对其生物活性进行检测，以期为进一步的开发利用黑果枸杞内生真菌资源奠定基础.

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

超净工作台,(ZHJH-C11098)，上海智城分析仪器制造有限公司；手提式蒸汽压力灭菌锅(YX-2803)，江阴滨江医疗设备有限公司；恒温培养箱(DH5000B), 天津泰斯特仪器有限公司；酶标仪(HF2000)，北京华安麦科生物技术有限公司；costar96孔酶标板(3590),美国Corning Costar公司；baygene移液枪,S200,北京百晶生物技术有限公司；试剂均为国产分析纯.

1.2 菌种和培养基

供试的黑果枸杞内生真菌RER4为本实验室自行分离得到.

测试菌：大肠杆菌(E.coli)，绿脓杆菌(P.aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporium)，番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea)，小麦赤霉病菌(Gibberellasaubinerii)，苹果树腐烂病菌(Cytosporamandshurica).

马玲薯葡萄糖液体培养基：将马玲薯洗净去皮，切片煮沸0.5 h，以纱布过滤，加入葡萄糖20 g，溶化后加水至1 000 mL.

NA培养基：牛肉膏3.0 g，琼脂20 g，蛋白胨10 g，氯化钠l 5 g，水1 000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min.

1.3 菌株的培养

内生真菌的培养：马玲薯葡萄糖液体培养基培养，28 ℃，120 rpm摇瓶培养6 d，将上述种子液按照培养基10%的量加入灭菌后的大米培养基中，室温下静置培养28 d；测试菌分别由培养基NA、马玲薯葡萄糖液体培养，28 ℃培养48 h，备用.

1.4 提取与分离鉴定

将内生真菌RER4发酵产物干燥、粉碎、浸泡后，经除糖处理得到浸膏，通过硅胶柱洗脱，得到5个组分Fr.1-Fr.5.其中对Fr.2(65 g)和Fr.3(60 g)以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，经多次使用硅胶柱层析、凝胶柱层析、重结晶等手段，从Fr.2分离纯化到化合物1～5，从Fr.3分离纯化得到化合物6～11.通过核磁共振、高分辩质谱对上述化合物的结构进行鉴定，依次为麦角甾醇(1)、尿黑酸内酯(2)、6-柠檬酸甲酯(3)、1,5-柠檬酸二甲酯(4)、5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid(5)、2,5-二羟基苯乙酸甲酯(6)、pyranonigrins A(7)、campyrones A(8)、4-乙酰氨基丁酸(9)、rubrofusarin B(10)、asperpyrones A(11).

1.5 抗菌活性测定

[17]的方法，将黑果枸杞内生真菌RER4次生代谢产物分离纯化后得到的11个化合物的抑菌活性进行测试.分别选取细菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，大肠杆菌(E.coli)，绿脓杆菌(P.aeruginosa)和真菌尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporium)，小麦赤霉病菌(Gibberellasaubinerii)，苹果树腐烂病菌(Cytosporamandshurica)，番茄灰霉病菌(Botrytiscirerea).将倍半稀释后的不同浓度化合物添加到营养肉汤培养基中作为实验组，以溶解化合物的试剂为空白组.再将活化后的指示菌配成105cfu/mL的菌悬液并接种，37 ℃培养24 h.观察培养管底部是否有沉淀或浑浊，当某一混合溶液透明澄清，则说明化合物在此浓度可以抑制该菌生长，该浓度即为样品的最小抑菌浓度MIC.

1.6 抗氧化性测定

参照文献[18]，对96孔板编号，按编号采用倍比稀释法向各孔中分别注入100μL不同浓度的化合物的2 000μg/mL的甲醇溶液，再分别注入100μL 0.1 mg/mL DPPH甲醇溶液，混合，避光、室温存放30 min，将酶标板在波长为517 nm下的酶标仪中测定吸光度，记录每个孔中的吸光度值，重复实验3次，以Vc为对照品，计算样品对DPPH自由基清除率.

2 结果与讨论

2.1 抑菌活性的测定

对分离纯化得到的11个化合物的抑菌活性测试结果见表1.

表1 化合物抑菌活性测试结果

注：①CK1青霉素钠，CK2硫酸链霉素，CK3酮康唑；②A大肠杆菌(E.coli)，B绿脓杆菌(P.aeruginosa)，C金黄色葡萄球菌(S.aureus)，D枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，E尖孢镰孢菌(F.oxysporium)，F小麦赤霉病菌(G.saubinerii)，G苹果树腐烂病菌(C.mandshurica)，H番茄灰霉病菌(B.cirerea).

抑菌活性测试结果表明：11个化合物中有9个化合物对4株细菌和4株真菌生长表现出不同程度的抑制作用.其中尿黑酸内酯和2,5-二羟基苯乙酸甲酯对细菌和真菌均表现出较好的抑制作用，最小抑菌浓度达到7.8μg/mL；化合物pyranonigrins A和asperpyrones A对细菌生长有较好的抑制作用；化合物5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid对革兰氏阳性菌生长有较好的抑制作用，最小抑菌浓度为31.2μg/mL.

2.2 化合物的抗氧化活性

采用DPPH法对分离纯化得到的含有酚羟基或者烯醇式结构的化合物尿黑酸内酯、2,5-二羟基苯乙酸甲酯、pyranonigrins A、rubrofusarin B、asperpyrones A的抗氧化活性测试，以试样浓度和清除率为指标进行回归分析，计算IC50，测试结果见表2所示.

表2 自由基清除率测试结果

从表2看出，6个化合物的抗氧化活性强弱顺序为：尿黑酸内酯>2,5-二羟基苯乙酸甲酯>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B，其中尿黑酸内酯、2,5-二羟基苯乙酸甲酯对DPPH的自由基清除率与Vc相当.结合化合物结构(见表3所示)，分析化合物抗氧化性的构效关系如下：

(1)尿黑酸内酯、2,5-二羟基苯乙酸甲酯具有较强的抗氧化活性，是由于结构中易氧化的酚羟基比例相对比较大；

(2)pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B，虽然三者都含有可形成氢键的酚羟基结构，但pyranonigrins A相对较难形成氢键，因而抗氧化活性强于后两者；而asperpyrones A强于rubrofusarin B的原因在于其结构上含有一个可游离的酚羟基，其活性弱于pyranonigrins A的原因可能为其羟基处于的位置空间位阻较大，不易被氧化有一定关系.

对比结构，结合试验结果可得出结论：

(1)尿黑酸内酯和2,5-二羟基苯乙酸甲酯属于尿黑酸衍生物，从而推测具有尿黑酸结构的化合物具有较强的抗氧化性.

(2)化合物抗氧化活性强弱取决于结构上是否含有易被氧化的基团，该基团所连接位置的共轭链长短及空间位阻对其抗氧化活性具有较大影响.

3 结论

通过抑菌活性和抗氧化活性测试结果表明，尿黑酸衍生物具有广谱的抑菌作用，内生真菌RER4有望成为新的抗氧化和抗菌药物的来源.也表明了植物内生真菌具有丰富多样的次生代谢产物，是开发新型药物的重要来源.

表3 不同化合物的化学结构及IC50值

续表3

化学结构化合物IC50(μg/mL)PyranonigrinsA46.97RubrofusarinB401.77AsperpyronesA391.12

参考文献

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Antimicrobial activity of the secondary metabolites of endophytic fungi RER4 fromLyciumruthenicum

YANG Xiu-fang， WANG Peng-fei, MA Yang-min, JIA Qiang-qiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Shaanxi University of Science &Technology, Xi′an 710021， China)

The Minmum Inhibiting Concentration (MIC) of 11 compounds isolated from theLyciumruthenicumRER4 fungal secondary metabolites. were measured by microdilution method on 96-well plates againstE.coli,P.aeruginosa,S.aureus,B.subtilis，F.oxysporium，G.saubinerii，C.mandshurica，B.cirerea.The results showed that 9 compounds exhibited different inhibition to bacterial and fungal growth.5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one and methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl)acetate shown better inhibition to both bacteria and fungi,pyranonigrins A and asperpyrones A exhibited better bacterial growth inhibition,5-hydroxymethylfuran-3-carboxylic acid shown a special interesting to Gram-negative bacteria.5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one,methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl and pyranonigrins Al had notable inhibiting microorganism activity to bacteria with the MIC7.8μg/mL.The antioxidant effects of compounds 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one,methyl 2-(2,5-dihydroxyphenyl)acetate,pyranonigrins A,rubrofusarin B,asperpyrones A were tested.The DPPH radical-scavenging capacity was measured against various concentrations with ascorbic acid as contrasts.The result of antioxidant activity test showed that the antioxidant activity of 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one and methyl 2-(2, 5-dihydroxyphenyl)acetate was equal to vitamin C for DPPH.Form strong to weak ordering 5-hydroxybenzofuran-2(3H)-one>methyl 2-(2, 5-dihydroxyphenyl)acetate>pyranonigrins A>asperpyrones A>rubrofusarin B.

endophytic fungi;Lyciumruthenicum; metabolites; antimicrobial activity; antioxidant activity; QSAR

2015-01-02

教育部高等学校博士学科点专项基金科研项目(20116125110001)

杨秀芳(1963-)，女，陕西铜川人，教授，研究方向：天然产物的研究与开发

1000-5811(2015)03-0125-05

R932

A