响应曲面法优化黑木耳多糖的硫酸化工艺研究

李婷婷 王振宇 尹红力 刘冉 张乃珣

摘要 [目的] 优化黑木耳多糖的硫酸化工艺。[方法]用硫酸法对黑木耳多糖进行硫酸化修饰，用响应面法研究了修饰条件中反应时间（A）、反应温度（B）和反应试剂配比（正丁醇∶浓硫酸）（C）3个因素对产物的硫酸基取代度的影响，并建立回归模型，验证其有效性。[结果]试验表明，在反应温度为-20～28 ℃、反应时间为0.5～2.5 h、反应试剂配比（正丁醇∶浓硫酸）为1∶2～1∶4范围内，3个因素与产物平均取代度（Y）的回归模型为Y=0.54-0.011A-0.008 8B- 0.017C+0.029A×B-0.044A×C +0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2；F检验证明模型拟合较好，可以用于量化控制条件；3个因素对取代度的影响程度为C>A>B，并且各因素之间交互影响显著。[结论] 对黑木耳多糖进行硫酸化修饰可提高其硫酸化程度，从而增加黑木耳多糖的生物活性。

关键词 响应曲面；黑木耳多糖；硫酸化

中图分类号 S509.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）11-263-04

硫酸化修饰是指通过化学的方法在多糖的结构中，引入硫酸根基团。多糖经过硫酸化后，在分子结构中引入了带有负电荷的硫酸根基团，整个分子会显示聚阴离子特性，可以阻断病毒与机体细胞的吸附，从而增加天然多糖的多种生物学活性[1-2]。黑木耳是药食同源真菌，属真菌类担子菌纲，主要分布在我国东北地区的大、小兴安岭。黑木耳不仅具有很高的营养价值，还具有多种药理功能[3-4]。国内外文献报道，黑木耳具有抗氧化[5-7]、降血脂[8]、降血糖[9]、抗肿瘤[10-11]和抗凝血[12-13]、抗菌[14]等活性，但多糖的水溶性差限制了其活性更好地发挥，而化学修饰可以提高多糖在水中的溶解度，增强其生物活性。

研究表明，硫酸化多糖的生物活性与硫酸化的程度有一定的关系[15]，笔者是通过用浓硫酸法对黑木耳多糖进行修饰，用响应曲面法对黑木耳多糖的硫酸化修饰进行工艺优化，以期达到提高其硫酸化程度，从而增加黑木耳多糖的生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料 供试原料：黑木耳。主要试剂：氯化钡、明胶、硫酸铵、氢氧化钠、石油醚、无水乙醇、丙酮、正丁醇、浓硫酸、氯仿、三氯乙酸、盐酸，均为分析纯。主要仪器：

台式离心机TDL-5，上海科兴仪器有限公司；

722可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；

旋转蒸发仪R-205B，上海申胜仪器公司；

电热恒温水槽DK-8D型，上海一恒科技有限公司；

高速万能粉碎机FJ-200，天津泰斯特仪器公司；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9240，上海一恒科技有限公司；

电子天平YP200lN，上海精天电子仪器厂；漩涡混合器XW-80A，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 黑木耳多糖的提取和精制

将黑木耳清洗干净，置于烘箱中烘干，进行粉碎，过60目筛，使用石油醚将过筛后的黑木耳粉脱脂。以料液比1∶90 g/ml的比例，将脱脂后的黑木耳粉分别浸于纯水中，在90 ℃下搅拌提取3 h，4 000 r/min离心15 min，收取上清液，残渣重复提取3次，将提取液进行脱色处理，用3% H2O2 在50 ℃温度下，保温脱色2 h，使用saveg法除去蛋白，然后用流动水透析12 h，蒸馏水透析12 h，透析液用80%无水乙醇进行醇沉，沉淀物用丙酮、乙醚清洗除杂，将清洗后的沉淀物干燥至恒重，得到黑木耳多糖[16-17]。用苯酚-硫酸法测定糖含量为85.9%，考马斯亮蓝法测定其蛋白含量为1.3%。

1.3 单因素影响试验 主要考察反应时间、反应温度、反应试剂比例对硫酸化黑木耳多糖取代度的影响。

1.4 多糖硫酸化修饰响应面试验设计

选取硫酸用量、反应温度和反应时间3个因素，以所制备的黑木耳硫酸酯的硫酸基取代度（DS）为响应值，用Box-Behnken设计了3因素3水平试验，根据单因素试验，3个因素的水平值区间一般在如下范围：温度-20～28 ℃，反应时间0.5～2.5 h，反应试剂配比为1∶2～1∶4，同时考虑模型设计要求值须在中心点周围对称分布，故所取因素水平中心点为反应温度4 ℃，反应时间1.5 h，反应试剂（正丁醇∶浓硫酸）配比1∶3，中心点和中心点两侧的水平取值代号0、1和-1表示（表1），3因素3水平共17个试验。

1.5 黑木耳多糖硫酸酯化操作

按试验设定的正丁醇和浓硫酸的体积比例，置于带干燥和搅拌装置的反应瓶中，再加入硫酸铵0.125 g，冰浴冷却至0 ℃，搅拌30 min，缓慢加入多糖粉末0.5 g，放入特定的温度下反应相应的时间。反应结束后用5 mol/L 氢氧化钠调pH 8.0，混合溶液经透析，浓缩，冷冻干燥所得产物即为硫酸化黑木耳多糖[18]。

1.6 硫酸化黑木耳多糖取代度测定

用氯化钡-明胶法。取1 mol/L HCl溶解K2SO4使其浓度为1.087 5 mg/ml，分别吸取该溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.16、0.18、0.20 ml，用1 mol/L HCl补足至0.2 ml，分别加入三氯乙酸3.8 ml，氯化钡-明胶溶液1.0 ml和明胶溶液1.0 ml充分混合后室温静置15 min，用分光光度计测定混合液360 nm处的吸光值，记录各组氯化钡-明胶组与明胶组吸光值之差，以硫酸根浓度为横坐标，差值为纵坐标绘制标准曲线。将样品溶于1 mol/L HCl配成1 mg/ml的溶液，100 ℃水浴中水解4 h。取2份0.2 ml水解液，同法测定氯化钡-明胶组和单一明胶组的吸光值，计算两组之差。将测样差值代入标准曲线，得样品溶液中硫酸基浓度S%，S%除以样品浓度（1 mg/ml）得固体样品中硫酸基的质量分数S%[19-20]。取代度计算公式：

DS=（1.62×S%） /（32-1.02×S% ）。

1.7 回归模型的建立

以17次试验反应条件编码值（A、B、C）为自变量，以产物的DS为响应值（Y），用Design-Expert软件拟合多元回归模型： Y=k0+k1×A+k2×B+k3×C+k4×A×B+k5×A×C+k6×B×C+k7×A2+k8×B2+k9×C2，求最佳k0～k9值，生成回归方程。

1.8 回归模型的参数分析

对回归方程进行方差分析，将总方差变异来源拆分为回归模型、失拟指数（lack of fit value）和纯误差3项。如果回归模型未达到显著水平（P>0.5），表示该模型不适合用来解释和预测此试验；如果失拟指数达到显著水平（P<0.5），表示各试验点实际值偏离理论值过大，拟合效果较差。

将方差分析结果中模型变异来源拆分成各因素及其交互项，根据F值判定其对响应值的影响是否显著，及影响程度大小。将3个因素中的1个因素编码值取0，得到其他2个因素对响应值影响的方程，作相应的三维曲面图和等高线图分析这种影响的变化趋势，可得到显著水平的交互效应。

1.9 回归模型的有效验证

将A、B、C分别取值为-1、0、1，在此条件下重复3次试验，试验结果用t检验判定是否与理论值相符。

2 结果与分析

2.1 反应时间对硫酸化黑木耳多糖取代度的影响

固定反应温度为0 ℃，浓硫酸与正丁醇的比例为3∶1，选择不同的反应时间，按硫酸化操作方法进行对黑木耳多糖的分子修饰。如图1所示，反应时间在1 h时，取代度最可达0.47，时间越长，取代度反而下降。

2.2 反应温度对硫酸化黑木耳多糖取代度的影响

固定反应时间为1 h，浓硫酸和正丁醇体积比3∶1，改变反应温度，以测定其对黑木耳多糖硫酸化反应取代度的影响。由图2所示，当反应温度为4 ℃时，取代度较高，但随着温度的继续提高，酯化产物的取代度明显下降。所以低温更加利于浓硫酸酯化反应。

2.3 反应试剂比例对硫酸化黑木耳多糖取代度的影响

固定反应时间为1 h，反应温度为4 ℃，改变浓硫酸和正丁醇体积比，以考察不同反应试剂的比例对硫酸酯化取代度的影响。由图3可知，硫酸酯产物的取代度随着浓硫酸含量的增加呈先提高后下降的趋势，而过高的浓硫酸含量会导致产物取代度的下降。

2.4 响应面试验响应值 17次试验结果见表2。

2.5 回归模型

硫酸基平均取代度（Y）与反应时间（A）、反应温度（B）、正丁醇∶浓硫酸（C） 3个因素编码空间的多元回

归方程：Y=0.54-0.011A-0.008 8B-0.017C+0.029A×B-0.044A×C+0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2。

2.6 回归模型的有效性 回归模型的方差分析得出：F回归模型=262.48，P回归模式<0.0001；F失拟=4.42，P失拟=0.092 6。

由此可见，失拟指数P值为0.092 6大于0.05，表明回归方程无失拟因素存在，回归式拟合得较好。回归方程显著检验P值小于0.01，表明回归方程达到极显著，在试验范围内可以用来解释和预测试验结果。

2.7 回归模型参数分析 回归模型的参数估计值如下：F模型=262.48，P模型<0.000 1；FA=14.70，PA=0.006 4；FB=9.17，PB=0.019 2；FC=33.57，PC=0.000 7；FAB=49.35，PAB=0.000 2；FAC=114.59，PAC<0.000 1；FBC=6.24，PBC=0.041 1；FA2=822.32，PA2<0.000 1；FB2=1 129.50，PB2=0.001 2；FC2=27.22，PC2<0.000 1。

由此可见，模型中A、C、AB、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.01，表明它们对黑木耳多糖硫酸化产物平均取代度有极显著的影响，B、BC的P值均小于0.05，表明其对取代度影响显著（P<0.05）。

同时，根据F值大小可推知，试剂比例对黑木耳多糖硫酸酯硫酸取代度的影响最大，其次是反应时间，最后是反应温度，即试剂比例>反应时间>反应温度。

利用Design Expert 7.0 软件对二次回归模型进行规范分析，得到反应时间、反应温度、试剂比3 个因素之间的响应面立体分析图及相应的等高线图，见图 4、5、6。预测最佳点为A=1.43，B=-1.48，C=1∶3.96，分别对应反应时间、反应温度以及实际配比，以此估计响应值的理论值为0.539 5。

2.8 验证试验

由于实验室条件限制采用优化条件反应温度 4 ℃、反应时间1.4 h、 试剂配比为1∶4进行3 次平行试验的取代度分别为0.520 2、0.509 7、0.521 1，平均为0.517 0，预测值与实际值接近。因此，通过响应面优化法得到的硫酸酯化黑木耳多糖的合成工艺可以用来指导实际生产。

3 结论

常用的多糖硫酸化方法有浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸-吡啶法，浓硫酸有低毒、操作方便、收率较高等优点，故该试验采用浓硫酸法进行修饰。该试验结果表明，采用浓硫酸法将黑木耳多糖进行硫酸化修饰切实可行。当反应时间和温度一定，硫酸化多糖的取代度随反应试剂中的浓硫酸与正丁醇的比例呈先升高后减少的趋势，原因可能是由于增加了浓硫酸的用量，使黑木耳多糖降解。所以适当的浓硫酸与正丁醇的比例会使多糖充分获得硫酸基。当其他条件不变，随着反应温度的升高，样品的硫酸化取代度先升高后降低，原因可能是温度升高有利于反应的进行，但在酸性条件下温度过高会使灵芝多糖发生降解。因此，在单因素试验和响应曲面设计的试验结果的基础上，确定黑木耳多糖硫酸化最佳的条件为：浓硫酸和正丁醇的体积比为1∶4，温度为4 ℃，反应时间1.4 h，在此条件下，硫酸化产物取代度为0.517 0。

参考文献

[1]

唐平，俞卫平，支明玉.黑木耳的开发研究进展[J].农产品加工（学刊），2012（5）：99-102.

[2] 申进文，王瑞瑞，许春平.秀珍菇多糖的硫酸化及其生物活性研究[J].河南农业科学，2014（7）：102-106.

[3] 陈炼，吴琼英.多糖的结构修饰及其生物活性研究进展[J].农产品加工（学刊），2012（10）：103-106.

[4] 李小定，荣建华，吴谋成.真菌多糖生物活性研究进展[J].食用菌学报，2002（4）：50-58.

[5] FAN L S，ZHANG S H，YU L，et al.Evaluation of antioxidant property and quality of breads containing auricularia auricula polysaccharide flour[J].Food Chemistry，2007，101（3）：1158-1163.

[6] 赵永安，陈冠，陶遵威.苦豆子多糖及其衍生物的体外抗氧化活性[J].中国实验方剂学杂志，2013（5）：229-232.

[7] 张丽霞，赵丽娟.金针菇多糖的抗氧化活性研究[J].西南农业学报，2014（1）：240-243.

[8] ACHARYA K，SAMUI K，RAI M，et al.Antioxidant and nitric oxide synthase activation properties of Auricularia auricular[J].Indian Journal of Experimental Biology，2004，42（5）：538-540.

[9] TAKEUCHI H，HE P，MOOI L Y.Reductive effect of hot-water extracts from woody ear （Auricularia auricula-judae Quel.） on food intake and blood glucose concentration in genetically diabetic KK-Ay mice[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2004，50（4）：300-304.

[10] MA Z C，WANG J G，ZHANG L N，et al.Evaluation of water soluble beta-d-glucan from auricularia auricular-judae as potential anti-tumor agent[J].Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：977-983.

[11] 史宝军，聂小华，许泓渝，等.灰树花多糖硫酸酯的制备及其抗肿瘤活性[J].中国医药工业杂志，2003（8）：17-19.

[12] YOON S J，YU M A，PYUN Y R，et al.The nontoxic mushroom auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated byantithrombin[J].Thrombosis Research，2003，3（112）：151-158.

[13] 张建荣，刘文广，李永胜，等.类肝素寡糖/多糖衍生物抗凝血材料的研究进展[J].化工进展，2003（7）：699-702.

[14] 刘莹，许琳，赵杰.金针菇多糖衍生物的制备及其抗菌性的测定[J].食品工业科技，2013（6）：137-139.

[15] 闫亚美，冉林武，刘兰英，等.硫酸酯化多糖生物活性及其构效关系研究进展[J].安徽农业科学，2009（24）：11374-11375.

[16] 魏红，吴向阳，仰榴青，等.黑木耳多糖的提取工艺[J].食品研究与开发，2010（5）：109-112.

[17] 陆雯，蔡振优，鲜乔，等.黑木耳多糖提取工艺条件的研究[J].中国食品添加剂，2010（6）：99-102.

[18] 申进文，冯雅岚，余海尤，等.硫酸化分级香菇多糖抗氧化活性研究[J].菌物学报，2010（3）：449-453.

[19] 张帆，王德云，赵晓娜，等.响应面法探讨氯磺酸-吡啶法修饰条件对硫酸化当归多糖取代度的影响[J].天然产物研究与开发，2010（5）：830-835.

[20] 胡礼勇，张健，郑波，等.牛膝多糖衍生物的几种取代度测定方法的探讨[J].天然产物研究与开发，2004（6）：491-495.

责任编辑 李菲菲 责任校对 李岩