BolSDG8玆NA干扰载体构建和拟南芥的遗传转化

常诚　姜玲　阮颖

摘要拟南芥SDG8通过调控开花关键基因FLC位点上H3K36 的甲基化水平促进其转录表达进而抑制植株早花。甘蓝BolSDG8是拟南芥SDG8的同源基因，经比对，选择一段约为359 bp的保守序列，命名为BolSDG8RNAi，通过构建RNA干扰载体，并将其转化至野生型拟南芥（Col0）中，获得了稳定遗传的转基因植株。通过对T3代转基因植物的表型观察，开花天数及莲座叶数目的统计分析，发现BolSDG8 RNA干扰转基因植株表现出与拟南芥sdg82突变体相似的生物学表型，即植株弱小，明显早花，暗示BolSDG8与拟南芥SDG8在调控植物开花上具有相似的生物学功能，为进一步深入研究甘蓝BolSDG8的生物学功能奠定基础。

关键词BolSDG8；RNA干扰；拟南芥；遗传转化

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）16-036-03

RNA Interference Vector Construction of BolSDG8 and Genetic Transformation of Arabidopsis thaliana

CHANG Cheng， JIANG Ling， RUAN Ying

（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

AbstractArabidopsis SDG8 specifically regulates methylation of H3K36 on the flowering key gene FLC， to promote its transcriptional expression and inhibit early flowering in plants. BolSDG8 of Brassica oleracea is a homologous gene of SDG8 of Arabidopsis thaliana. By blasting， a conserved sequence of 359 bp named BolSDG8RNAi was selected via construction of RNA interference vector and genetic transformation into wildtype Arabidopsis plants （Col0）， and obtained one transgenic plant with stable inheritance. Through phenotype observation of transgenic plants in T3， and analysis of days to bolting and rosette leaves number， it was found that BolSDG8 RNAi transgenic plants in Arabidopsis showed similar biological phenotypes to sdg82 mutants， weak and significantly early flowering， laying a foundation for further study of biological function of BolSDG8.

Key wordsBolSDG8； RNA interference； Arabidopsis thaliana； Genetic transformation

開花是植物生长发育的重要环节，植物的花期对于植物维持正常的生命周期具有重要意义。研究表明，植物开花至少受到5条主要途径调控：光周期途径、春化作用途径、GA途径、自主途径和表观遗传调控途径。组蛋白甲基化修饰作为重要的表观遗传调控方式，积极参与到植物开花调控网络中。拟南芥SDG8（SET DOMAIN GROUP 8）编码的组蛋白赖氨酸甲基转移酶是酵母SET2的同源物[1-2]，包含约1 806个氨基酸序列，其中含一个CW（cysteine and tryptophan conserved）结构域、一个AWS（Associated With SET）结构域、一个SET结构域和一个Post SET结构域[3]，能特异性地催化组蛋白H3第36位赖氨酸（H3K36）发生双、三甲基化修饰。功能缺失的拟南芥sdg8突变体，其植株表现为弱小、早花，而究其早花原因，是由于其H3K36的双、三甲基化水平显著降低，开花关键基因FLC转录受到抑制，进而使植株表现为早花。因此，拟南芥SDG8介导的H3K36甲基化在抑制植物早花过程中起着重要作用。

甘蓝BolSDG8是拟南芥SDG8的同源基因。生物信息学分析表明，BolSDG8全长cDNA为5 088 bp，编码1 696个氨基酸，与拟南芥SDG8氨基酸序列的同源性达到87%，也包含一个CW结构域、一个AWS结构域、一个SET结构域和一个Post SET结构域。因此，笔者通过构建BolSDG8 RNA干扰载体和浸花法转化至野生型拟南芥（Col0），检测来自甘蓝BolSDG8基因的片段能否有效沉默拟南芥SDG8的功能[4]，进而研究甘蓝BolSDG8与拟南芥SDG8在调控植物开花上是否具有相似的生物学功能，为深入研究BolSDG8的功能奠定基础，同时为培育适当早花早熟的甘蓝型油菜品种[5]提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料

拟南芥哥伦比亚生态型Col0和突变体sdg82；大肠杆菌（E.coli）DH5α；根癌农杆菌GV3101；载体pMD19 T vector和pFGC5941，均由湖南农业大学植物发育与表观遗传调控实验室提供。

1.2方法

1.2.1甘蓝BolSDG8RNAi的克隆。

通过比对拟南芥SDG8与甘蓝BolSDG8cDNA序列，选择一段约359 bp的保守序列，命名为BolSDG8RNAi，设计引物序列：

BolSDG8RNAi F：

5′GGCGCGCC GGATCC AAGATTCCTTCCCCACTTTCGTCAT3′（AscI/BamHI）

BolSDG8RNAi R，

5′ CCATGG TCTAGATTCATGACACTGAATGGGAATGAGG3′（NcoI/XbaI）。

采用高保真酶PCR扩增后，获得目的片段。对其回收并连接至pMDl9T载体，命名为pMDl9TBolSDG8RNAi，经热激法转化至大肠杆菌DH5α中，挑选阳性单菌落送至公司测序。

1.2.2RNAi干扰载体的构建。

首先使用BamH I和Xba I双酶切载体pMDl9TBolSDG8RNAi和pFGC5941（图1），将BolSDG8RNAi反向插至查尔酮内含子与终止子之间，获得载体pBolSDG8RNAi；然后使用Asc I和Nco I双酶切载体pMDl9TBolSDG8l和pBolSDG8RNAi，将目的片段正向插至35 S启动子与查尔酮内含子之间，获得干扰载体pFGC5941BolSDG8RNAi。

1.2.3拟南芥的遗传转化。

将pFGC5941BolSDG8RNAi转至农杆菌GV3101中，挑选阳性克隆用于拟南芥的遗传转化。

采用浸花法[3]将该质粒转至野生型拟南芥（Col0），采用浓

注：a.片段克隆；b.pFGC5941BolSDG8RNAi干扰载体。

图1RNA干扰载体构建

度30 mg/ml PPT喷施拟南芥幼苗进行筛选，对获得的抗性苗使用如下引物进行PCR检测，确认是否为转基因植株。

35S825 F：5′ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT3′；

Intron825 R：5′TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC3′。

1.2.4转基因植株的表型观察与生物学统计。

对生长于长日照条件下（16h/8h）的野生型拟南芥Col0、突变体sdg82和转基因植株分别进行开花天数和抽薹时莲座叶数目的统计，并拍照。

2结果与分析

2.1BolSDG8RNAi的克隆

通过比对，选择一段359 bp

的保守序列作为RNAi干扰片段（图2），克隆到BolSDG8RNAi目的片段，并将其连接至pMDl9T载体上，经热激法转至大肠杆菌DH5α中，挑选阳性单菌落送至公司测序，经比对，目的片段与预期片段大小完全一致（图3）。

注：M.Marker；1.BolSDG8RNAi PCR扩增；+.阳性对照；—.阴性对照。

图2BolSDG8RNAi基因PCR电泳图谱

图3BolSDG8RNAi序列对比

2.2BolSDG8干扰载体构建

根据图1所示，将BolSDG8RNAi正反插至pFGC5941载体上，经酶切验证，BolSDG8干扰载体pFGC5941BolSDG8RNAi构建成功，酶切后的片段大小与预期相符（图4）。

2.3拟南芥的遗传转化

通过浸花法和PPT抗性筛选[6]，获得抗性苗（图5）。通过改良的CTAB法提取抗性苗总DNA，并进行分子检测，结果显示，抗性苗为转基因植株（图6）。转化共计42株，分株收取种子。经检测共计3株完成转化，将转化苗命名为BolSDG8RNAi。

2.4BolSDG8RNAi转基因植株表型

在长日照条件下，观察生长35 d的T3代BolSDG8RNAi转基因拟南芥植株，与Col0相比，BolSDG8RNAi转基因植株长势弱小，明显早花，其

整体生物学表型与sdg82突变体相似（图7）。由图8可知，

注：M.Marker；1.未酶切质粒；2.Asc I +Nco I双酶切；3.BamH I单酶切；4.Xba I单酶切。

图4pFGC5941BolSDG8RNAi的质粒酶切

图5BolSDG8RNAi抗性平板筛选

注：M.Marker；1～3.BolSDG8RNAi抗性苗；+.阳性对照；—.阴性对照。

图6BolSDG8RNAi抗性苗PCR检测电泳图谱

无论是莲座叶数目还是开花天数，BolSDG8RNAi转基因植株明显少于Col0，接近于sdg82，这进一步证实了BolSDG8RNAi转基因植株具有与拟南芥sdg82突变体相似的早花表型。

3讨论

组蛋白赖氨酸甲基化修饰是一种重要的表观遗传学标记[7]，也是参与开花调控的重要途径之一[8]。其主要通过改

图7生长35 d的sdg82、BolSDG8RNAi和Col0

图8拟南芥莲座叶数目和开花天数

变染色质结构来影响基因的转录表达，使其在植物生长发育过程中起到了重要作用[9]。组蛋白赖氨酸甲基化修饰是通过特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶催化实现的[10]。组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histonelysine methyltransferase，HLMT）是一类含有SET结构域的蛋白[11]，进化上保守的SET结构域包含约130个氨基酸序列，形成一个结状结构的酶催化中心。AtSDG8是在拟南芥中发现的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，能特异性地催化组蛋白H3K36发生双、三甲基化，导致开花关键基因FLC表达水平下降，从而使植物早花[12]。

AtSDG8以130多个碱基对形成一个节状的酶催化中心[13]，即组蛋白甲基化转移酶，该转移酶通过催化组蛋白的甲基化来影响整个组蛋白结构，从而达到调控基因表达的目的[14]。

在开花天数上，sdg8相对于野生型Col开花时期更早，BolSDG8RNAi相对sdg8较晚，但明显早于Col，两者相对于Col都有明显的早花现象。在莲座叶数目上，BolSDG8RNAi更接近于sdg8，两者相对于Col在莲座叶数目上都较少。该试验结果基本符合试验预期，证明Bolsdg8与sdg8不但具有高度相似的序列和结构，在调控开花的生理功能上也十分类似。

甘蓝型油菜是甘蓝与白菜杂交后自然加倍而成的异源四倍体，具有来源于甘蓝的一对染色体，通过甘蓝早花基因BolSDG8的研究，将为进一步研究甘蓝型油菜开花机制，以及为选育适当早花早熟的甘蓝型油菜新品种来适应“稻稻油”耕作制度提供理论参考。

安徽农业科学2015年

參考文献

[1]

NG D W，WANG T，CHANDRASEKHARAN M B，et al.Plant SET domain-containing proteins：Structure， function and regulation [J].Biochim Biophys Acta， 2007， 1769（5/6）：316-329.

[2] ZHAO Z，YU Y，SHEN W H，et al.Prevention of early flowering by expression of FLOWERING LOCUS C requires methylation of histone H3 K36[J].Nature Publishing Group，2006，7（12）：1256-1260.