酶联免疫吸附法测定畜禽组织中恩诺沙星的残留量

杨华生

摘要利用抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，测定畜禽组织中恩诺沙星的残留量。结果表明，该检测方法简便、快速、灵敏。

关键词恩诺沙星；酶；抗原；抗体；底物；回收率

中图分类号S851.34+7文献标识码

A文章编号0517-6611（2015）24-114-02

恩诺沙星，又称乙基环丙沙星、恩氟沙星，相对分子质量为359.4，于1994年投放市场。该药具有广谱抗菌效果，对霉菌和革兰氏阴性菌效力强，具有很强的渗透性，能广泛分布于组织中，内服及肌肉注射可吸收迅速，30 min后血药浓度达高峰，血药浓度高，在体内代谢为同样具有抗菌活性的环丙沙星，几乎所有组织的药物浓度都高于血浆，特别有利于深部组织感染的治疗，代谢物生成及消除缓慢。为预防与治疗畜禽养殖过程中发生疾病，恩诺沙星被养殖户广泛和大量使用，同时也极容易形成此类兽药及其代谢物在养殖动物产品体内大量残留并最终被人类食用，从而导致人体内正常菌群产生耐药性，引发中毒或过敏反应，影响体内核酸的合成。此外，该类药物还能抑制小儿、孕妇和哺乳期女性软骨生长，对有药物过敏史或高敏体质者危害甚大，老年肝肾功能不全患者更易发生药物蓄积而增加不良反应。恩诺沙星与布洛芬等非甾体类抗炎药物合用可使神经兴奋阈值降低，引起抽搐，增加神经系统毒性等危害[1]，欧盟规定在可食用动物组织中该药的残留不能大于30 μg/kg。为此对畜禽组织中恩诺沙星残留进行测定，并及时规范市场，预防此类药物对消费者造成伤害，而目前对该药检测比较便捷、实用的方法就是使用酶联免疫吸附法检测方法。

1材料与方法

1.1主要仪器与设备

酶标仪（带450 nm波长滤光片）、 离心机、匀质机、涡旋振荡器、 恒温培养箱（0～50 ℃）、冰箱（4～8 ℃）、20～200 μl吸头及单道可调移液器、 20～300 μl 多通道可调移液器、V-型槽、 感量0.01 g的天平、洗板机、50 ml量筒、 500 ml烧杯、 酶标板密封膜。

1.2试剂

甲醇、蒸馏水、可拆式已包被恩诺沙星特异性抗体的聚苯乙烯微孔条（8行、12列）、浓度分别为0、0.5、1.5、4.5、13.5和40.5 ng/ml恩诺沙星标准品溶液、浓度为1 000 ng/ml恩诺沙星标准品为质控材料、稀释/洗涤缓冲液（浓缩）按照一定的比例稀释后用于酶标板的冲洗、酶标抗原（浓缩）用酶标抗原稀释液稀释后使用、单组分底物/发色剂用于酶的催化显色、反应终止液。除甲醇、蒸馏水、反应终止液外的试剂外在使用前均应储存于2～8 ℃的冰箱中。此外，不含恩诺沙星的样品作为质控QC，用于加标回收，对整个试验过程进行验证。

1.3原理

在酶标板上的微孔中已包被恩诺沙星的特异性抗体，通过加入恩诺沙星标液或组织样品中的恩诺沙星抗原和辣根过氧化物酶标记的恩诺沙星抗原争夺酶标板微孔上抗体的结合位点[2]，在室温孵育条件下发生竞争反应，形成抗体/抗原复合物或抗体/酶标抗原复合物，洗涤酶标板，除去游离的酶标记物，加上单组分底物/发色剂。在一定的温度范围内，酶标记抗原上的辣根过氧化物酶催化底物与发色剂发生显色反应。加入反应终止液后反应停止，同时反应物的颜色由蓝色转为黄色。在酶标仪上450 nm波长处测定相应的吸光度值，吸光度值与恩诺沙星浓度成半对数反比关系。

1.4试验方法

1.4.1组织样品的制备。

称取1.00 g均质后的组织样品加入4 ml 70%甲醇溶液并涡旋振荡1 min，4 000 r/min下离心10 min，移取上清液，用已稀释的稀释/洗涤缓冲液按1∶1的比例进行稀释，稀释好的样液用于试验分析，稀释倍数为8。只吸取上清液，而不要掺杂固体样品。

1.4.2吸光度的测定。

待所有试剂的温度恢复至室温（20～25 ℃）后，方可使用。为了降低边缘效应，建议在反应过程中用酶标板密封胶片将酶标板密封。每个标准、质控或样品要做2份平行试验，并做好加样位置的记录。酶标板微孔的指定位置如表1所示，每个代号格代表2个孔，平行排列，因此12列则为6列，一般情况下不会排满。

将足够标准和样品所用数量的微孔条插入酶标板。 用单道移液器吸取标准品或样品溶液50 μl，分别加入到指定的微孔中，然后用多通道可调移液器吸取75 μl酶标记物加入到每一个微孔中，用酶标板密封胶纸将酶标板盖住。 轻轻拍击酶标板数秒，室温（20～25 ℃）暗处温育30 min。 翻转酶标板，甩出所有溶液，用已设置好洗版程序的洗板机进行洗板（此清洗程序在没有条件的情况下进行手工操作），洗液为已稀释的稀释/洗涤缓冲剂，一般清洗由灌注到甩出要重复4～5次。最后1遍冲洗完后，将酶标板在吸水纸上拍干。（将液体甩出后不用翻转，避免各孔中液体交叉污染[3]，直接扣于吸水纸上拍干即可），立即移取125 μl底物到酶标板上，然后轻轻拍击酶标板，在室温（22～25 ℃）暗处温育20 min左右，直至显色充分，每孔加入100 μl终止液终止反应，颜色会由蓝色变为黄色，立即在波长450 nm酶标仪上读取吸光度。

1.5结果判定分别计算标准溶液、质控和样品的平均吸光值。以吸光度值为纵坐标，以标准浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线可得到质控和样品的吸光度值。将得到的数值乘以8即為实际结果。结果判定可采用定性及定量2种方法。

1.5.1定性分析。用样品的平均吸光度值与标准值进行比较，即得到其浓度范围。假设样品T1 的吸光度值为1.625，样品T2 的吸光度值为1.269，标准品浓度及相应吸光度值分别为：S1（0 ng/ml）为2.147，S2（0.5 ng/ml）为1.850，S3（1.5 ng/ml ）为1.498，S4（4.5 ng/ml）为1.194，S5（13.5 ng/ml）为0.852，S6（40.5 ng/ml）为0.490。

1.5.2定量分析。

1.5.2.1百分吸光率的计算。

按照以下公式计算标准品或样品的百分吸光率：

百分吸光率（%）=BB0×100%

式中，B为标准品或样品溶液的平均吸光度值；B0为0 ng/ml 标准溶液的平均吸光度值。

1.5.2.2标准曲线的绘制。

以标准品百分吸光率为纵坐标（Y轴），以恩诺沙星标准品浓度的对数为横坐标（X轴），绘制标准曲线。根据标准曲线得到标液或样品吸光度值与其浓度的函数关系为：y=-14.276lnx+76.282（R为0.999 6）。将样品的百分吸光率代入关系式中，得到样品所对应的浓度，乘以样品制备过程中对应的稀释倍数，即为样品中恩诺沙星的含量。

2结果与分析

2.1定性結果样品T1的浓度范围是0.5～1.5 ng/ml，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中恩诺沙星残留的浓度范围；样品T2的浓度范围为1.5～4.5 ng/ml，再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中残留药物的含量范围。

2.2定量结果样品T1、T2含量半定量分别为8.344和26.663 μg/kg。若以大于或等于30 μg/ml作为阳性判定标准，则T1和T2均为阴性样品。

2.3回收率验证

在质控样品QC1中加入100 μl浓度为1 000 ng/ml的恩诺沙星标准品作为质控品，理论添加水平为100 μg/kg，其加标样品参与整个制备过程，实际测试时QC的吸光度为0.881。根据标准曲线得到质控样品浓度，并乘以稀释倍数，实测含量为94.583 μg/kg。按照公式回收率R（%）=（加标样品实际含量/加标样品理论含量）×100%计算出回收率为946%。由此可见，该检测方法能充分满足要求。

3讨论

（1）与气质及液质联用方法相比，该检测方法的样品制备较为简便、快速，分析技术利用抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，具有耗时少、灵敏度高，通常从样品制备到分析测试结果在几个小时内完成，理论计算含量达到μg/kg级别，但药品的特异性抗体、包被抗体、催化底物的结合酶等制备要求条件很高，相当专业，成本也十分昂贵，一旦操作分析失误，会造成较大浪费。因此，整个分析操作过程在环境条件必须达到要求，操作要规范，并严格按照操作步骤进行。

（2）由于不同样品基质的复杂性以及样品制备过程可能产生某些未知副产物，从而与抗体发生某些非特异性吸附交叉反应，检测结果允许存在极少数量的假阳性，因而对阳性样品还要进一步进行定性分析。目前，比较常用的分析方法有液相/串联质谱（LCMSMS）、气相/串联质谱GCMSMS）。

参考文献

[1]

蒋萍.氟喹诺酮类药物的不良反应 [J].药学实践杂志，1999（2）：116-118.

[2] 陈佳，李红梅，徐斐，等.辣根过氧化物酶酶标抗原催化α萘酚微量热[J].食品科学，2009（17）：204-206.

[3] 于嘉屏.全自动生化分析仪及其试剂间化学污染对检测结果的影响[J].中国检验医学杂志，2007（11）：1301-1302.