天葵提取物对免疫抑制小鼠细胞因子的影响*

武 飞，肖 婉，徐 冉，王建塔，汤 磊，梁 冰＊

(1.贵州医科大学 药理学教研室，贵州 贵阳 550025;2.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

天葵为毛茛科多年生草本植物，可入药。富含造血功能的铁素、维生素A 原、黄酮类化合物及酶化剂锰元素，具有活血，解毒消肿等功效，在民间天葵常用于儿童和老人的保健，是一种很好的营养保健品［1－3］。本课题组前期研究发现天葵可增强正常小鼠的免疫功能。为了进一步探讨天葵对机体免疫功能影响可能的机制，本研究采用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，诱导免疫抑小鼠动物模型，利用酶联免疫吸附法(ELISA 法)检测小鼠血清中免疫相关的细胞因子，观察天葵—正丁醇提取物TK 对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，为天葵的进一步开发及临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与分组 清洁级昆明种小鼠50 只，l8～22 g，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号SYXK(黔)2012－0001。随机均分成TK 高、中、低剂量组、正常对照组(对照组)、CTX 免疫抑制模型组(模型组)。

1.1.2 TK 的制备 天葵药材购于贵阳市药材市场，经贵阳医学院龙庆德副教授鉴定为毛茛科天葵属植物天葵的干燥块根，产地贵州。将购买的天葵干燥粉碎，依次用甲醇回流提取和正丁醇萃取，得到TK，于－20 ℃保存，临用时用蒸馏水稀释至所需浓度(1 mg TK 相当于生药量20.7 mg)。

1.1.3 主要试剂 CTX 江苏恒瑞医药股份有限公司，14011725);白细胞介素－2(IL－2)、白细胞介素－4(IL－4)、白细胞介素－10(IL－10)及干扰素－γ(IFN－γ)ELISA 检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为H003、H005、H009 及H025)。

1.2 方法

1.2.1 CTX 免疫抑制小鼠模型的制备［4－5］对照组和模型组小鼠灌胃给予生理盐水0.2 mL/10 g;TK 高、中、低剂量组分别给予200 mg/kg、100 mg/kg 及50 mg/kg TK 灌胃，1 次/d，连续11 d。第9、第10 及第11 天灌胃后，模型组和TK 组腹腔注射CTX 100 mg/(kg·d);对照组注射等量生理盐水。

1.2.2 血清IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 含量检测 造模第12 天时，麻醉小鼠摘眼球取血，分离血清，采用ELISA 法检测血清中的IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 的含量，按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件对数据进行处理，计量资料用均数±标准差)表示，多组均数比较用单因素方差分析，两两比较采用t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

与正常对照组相比，模型组小鼠血清IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 含量明显降低，差异有统计学意义(P ＜0.05);与模型组相比，TK 高、中、低剂量组血清中的IL-2、IL-4 含量明显升高，TK 高剂量组血清中IFN－γ 含量明显升高，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

表1 各组小鼠IL－2、IL－4、IL－10 及IFN－γ 含量Tab.1 The level of cytokines in serum of the immunosuppressive mice induced by CTX

3 讨论

免疫抑制动物模型的制备方法很多，有免疫缺陷动物模型，如短寿新西兰鼠(NZB)、裸小鼠、MLR－lpr 小鼠及先天性补体C2、C4 缺乏小鼠等［4］。也可用免疫抑制剂CTX、氢化可的松、可的松或辐射方法制备免疫力低下动物模型，以CTX 最为常用。CTX 是一种细胞毒化疗药物，属于烷化剂类，能在细胞水平上干扰核酸的合成，用于多种肿瘤的治疗;CTX 同时亦是一种免疫抑制剂，在杀伤肿瘤细胞的同时，可损伤自身免疫细胞，造成机体免疫力低下［5］。用CTX 作为免疫抑制剂制备免疫抑制模型，可在细胞的各个时期发挥作用，不仅可抑制细胞免疫，还可抑制体液免疫。

细胞因子是由活化的免疫细胞和非免疫细胞经刺激而合成、分泌的具有多种生物活性的小分子蛋白质，包括白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、趋化因子(CF)及生长因子等［6］。血清中的IL－2、IL－4、IL－10 和IFN－γ 等细胞因子在机体内主要由活化的辅助性T 细胞(helper T cell，Th)分泌［6－7］。Th细胞前体(Th cell precursor)是未接触抗原的T 细胞，它们通过接触天然免疫细胞摄取的抗原而分化成一种不确定的状态，称为Th0细胞;随后Th0细胞再按一定比例分别向Th1亚群或Th2亚群分化［6－7］。Th1细胞主要分泌IL－2、IFN－γ 等细胞因子，主要介导细胞免疫反应，在诱发器官特异性自身免疫病、器官移植排斥反应和抗感染免疫中起着重要的免疫调节作用。Th2细胞主要分泌IL－4、IL－10 等细胞因子，主要调节体液免疫反应，在诱发过敏反应中起着决定性的作用。本次研究中通过ELISA 法检测了与细胞免疫和体液相关的细胞因子IL－2、IFN－γ 和IL－4、IL－10，结果表明TK 提取物各剂量组可显著提高免疫抑制模型小鼠血清中IL－2 含量;高剂量可显著提高小鼠血清中IFN－γ 含量;各剂量组也显著提高了模型小鼠血清中IL－4 含量，提示TK 提取物可同时增增强小鼠的细胞和体液免疫。增强小鼠的细胞免疫功能可能与提高血清中的IL－2 和IFN－γ 水平有关，而增强体液免疫功能可能与提高血清中IL－4 水平有关。分子机制有待进一步深入研究。

［1］Duan S，Pan Y，Jin CL，et al.A study on the inhibitory effect of Radix Semiaquilegiae extract on human hepatoma HEPG－2 and SMMC－7721 cells［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2013(5):336－340.

［2］Yang L，Wang JS，Kong LY，et al.Reversal effects of traditional Chinese herbs on multidrug resistance in cancer cells［J］.Natural Product Research，2012(19):1885－1889.

［3］张林和，屠春燕，于文涛，等.紫背天葵中营养成分及总黄酮分析［J］.氨基酸和生物资源，2004(3):3－5.

［4］宋雁，贾旭东，崔文明，等.不同途径和剂量环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的对比研究［J］.中国食品卫生杂志，2013(3):218－225.

［5］黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体之间的等效剂量换算［J］.中国临床药理学与治疗学，2004(9):1069－1072.

［6］彦爱，李波，李润成，等.香菇多糖和黄芪多糖对免疫抑制小鼠免疫功能调节的研究［J］.免疫学杂志，2012(11):999－1005.

［7］张李峰，蒲建中，鲍英存，等.比较同一复方中用红芪与用黄芪对免疫抑制小鼠淋巴细胞和Th1/Th2 型细胞因子的影响［J］.免疫学杂志，2012(28):212－216.