弓形虫PRU 株感染妊娠期小鼠动物模型的建立

程树强，王正蓉

(贵阳医学院附院 临检科，贵州 贵阳 550004)

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种机会性专性细胞内寄生原虫，可以感染包括人在内的所有哺乳动物、鸟类和爬行动物，从而导致严重的人兽共患病［1］。当孕妇感染弓形虫时，弓形虫可经胎盘感染胎儿导致流产、早产、胎儿畸形，同时还可导致存活的子代失明、精神发育迟缓等各种严重的远期后遗症［1］。为了研究弓形虫感染所导致的不良妊娠和先天性弓形虫病的发病机制，现已建立了各种动物模型，主要有大鼠、小鼠、羊和灵长类动物等。但不同种系的动物对弓形虫的易感性、感染后的症状及转归各有不同，同种动物不同遗传背景，所表现的病理特征及免疫状态也不尽相同。同时弓形虫虫株多样性，毒力不一，对同一动物不同生理阶段的感染能力、所致的疾病特征也各有不同［2］。本研究旨在建立合适而稳定的弓形虫先天性感染动物模型，为系统全面的研究弓形虫的生殖毒性及其致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 弓形虫虫株 弓形虫Prugniaud(PRU)株由蚌埠医学院孙新教授惠赠，在昆明小鼠体内传代保种。取已感染PRU 株的昆明鼠脑组织，放入无菌匀浆器内，用1 mL 无菌生理盐水进行研磨，制备成脑组织匀浆液。取10 μL 脑组织匀浆液压片后，在光学显微镜下共计数6 张玻片包囊数量取平均值(必要时再进行稀释)。即得到该匀浆液中每10 μL所含的包囊数，4 ℃保存脑匀浆液待感染动物。

1.1.2 实验动物 SPF 级6 ～8 周龄ICR 小鼠86只，体质量20 ～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2006—0009。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组及感染 将ICR 雌鼠86 只、雄鼠43 只按2∶ 1 随机合笼交配，每笼6 只或9 只。次晨开始查阴栓，查到阴栓者计为孕0 d，共获孕鼠77 只。38 只为孕早期组(孕1 d)，分为对照组6只、感染1 ～3 组分别为11、10 和11 只;39 只为孕晚期组(孕15 d)，分为对照组9 只和感染1 ～3 组各10 只。孕早期及孕晚期感染1 ～3 组孕鼠，分别灌胃含弓形虫PRU 株10、20 和40 个包囊的小鼠脑组织匀浆液，对照组灌胃等量生理盐水，分笼饲养，孕鼠正常取食和饮水。

1.2.2 观察指标 观察孕鼠生存状态、发病过程、不良妊娠结局及产仔数量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，率(%)的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 孕早期感染弓形虫对孕鼠及子代的影响

孕早期孕鼠在感染后第6 ～7 天开始发病，出现耸毛、倦怠、弓背、闭眼、食欲减退等症状(图1)，并于第8 天开始出现死亡，3 个小组在整个妊娠期间分别死亡4 只、5 只及11 只，死亡率达36.36%、50%和100%。对以10 个包囊感染孕鼠的小组中死亡的4 只孕鼠进行解剖见:腹水增加，甚至出现血性腹水，腹水涂片见大量白细胞、吞噬细胞和弓形虫假包囊;在整个妊娠过程中，从孕第9 天开始4 只孕鼠相继出现阴道流血，孕第17 天见一只孕鼠早产出泡状胚胎组织，剖开胎膜见仔鼠并未发育成熟(图2)。孕早期存活的7 只孕鼠仅一只产仔8只，不良妊娠结局高达85.71%。而对照组6 只孕鼠，共分娩仔鼠58 只，和感染组比较差异有统计学意义(P ＜0.01)。

2.2 孕晚期感染弓形虫对孕鼠及子代的影响

孕晚期感染后孕鼠在妊娠期发病不明显，在分娩时或分娩后表现烦躁不安，易咬食仔鼠。10 个包囊感染的10 只孕鼠，产仔鼠70 只，其中死胎4只;9 只对照组雌鼠产仔鼠85 只，未观察到死胎，两组产仔数量比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。以20、40 个包囊感染的孕鼠可正常分娩，但远期子代存活率小于85%。

3 讨论

弓形虫PRU 株为基因型Ⅱ型虫株，属于弱毒株弓形虫，是在欧洲导致人群弓形虫病感染和先天性弓形虫病主要的虫株［3－4］。我国对弓形虫研究的基础工作中多是基于导致严重眼弓形虫病(脉络膜视网膜炎)的基因型Ⅰ型的RH 毒力株，而对基因型Ⅱ型的PRU 株在我国人群先天性感染报道较少。本课题以基因型Ⅱ型虫株来建立动物先天性传播模型。

动物模型是研究弓形虫的致病机理和防治方法的基础，小鼠是研究弓形虫感染最常用的实验动物之一。目前学者们多建立ICR 小鼠的慢性感染模型来观察PRU 株感染后包囊形成、病理改变、机体免疫状态等，显示该小鼠适用于研究弓形虫PRU 株的感染［5］。而用ICR 小鼠建立先天性弓形虫传播的模型鲜见报道。本课题前期研究发现，用该虫株感染ICR 小鼠后表现出了一个急性发病期和慢性期的过程，符合该虫株感染的病原学特性［6］，因此选择ICR 小鼠作为先天弓形虫传播的实验动物。

图1 正常孕鼠和孕早期感染弓形虫孕鼠的临床表现Fig.1 Clinical manifestation of normal mice and early-pregnancy infection mice

图2 孕早期感染后不良妊娠结局表现Fig.2 Adverse pregnancy outcomes of early-pregnancy infection mice

弓形虫PRU 株有速殖子和缓殖子两种状态，前者有较强侵袭性，后者可在宿主脑组织内形成包囊，当宿主免疫系统受到抑制或功能低下时，又可出现弓形虫病的复发。本研究用弓形虫PRU 株对孕第1 天小鼠进行感染，发现孕鼠感染后第2 ～6天并不表现明显的临床症状，但至孕程第7 天后逐渐出现一个症状较重的急性期，到孕第18 天后逐渐恢复正常，符合弓形虫PRU 株的致病特点。

在建立动物模型的同时，由于同一动物不同生理阶段的感染能力、所致的疾病特征各有不同。因此有必要摸索ICR 小鼠是否适合建立弓形虫垂直传播的模型，以及较佳的弓形虫感染剂量，便于以后的进一步研究。在本实验中当弓形虫PRU 株感染剂量达20 包囊时，孕鼠死亡率高达50%;40 包囊感染时，孕鼠死亡率达到了100%，说明这两种感染剂量导致孕鼠在哺乳期发病及死亡率加大，使子代存活率过低，不利于进一步观察弓形虫感染所致的生殖毒性。因此选用10 包囊的低感染量，采用灌胃方式，模拟自然环境下的经口感染途径，建立垂直传播动物模型，期望为下一步的研究打下基础。

本研究还发现，在急性期内孕鼠除表现耸毛，倦怠、食欲不振、弓背及闭眼外，以10 包囊感染的孕早期组的孕鼠在孕程第9 天后出现了流产、早产现象，孕鼠的死亡率达36.36%，比吴升伟等［6］直接用PRU 株弓形虫感染非孕鼠死亡率(15%)高，并且急性感染症状几乎持续到妊娠末，导致不良妊娠结局发生率增高。孕晚期感染弓形虫对雌鼠所产仔数量影响不大，与孕早期感染弓形虫相比，对孕鼠和子代的影响不那么显著。同时观察到孕晚期感染组孕鼠在分娩过程及分娩以后，易咬食仔鼠，这可能是由于弓形虫对机体的毒性作用，导致雌鼠易激惹或弓形虫感染损伤了子代，致使雌鼠发生咬食仔鼠的现象，有待进一步研究。

综上所述，通过对10 个、20 个、40 个弓形虫PRU 株包囊感染孕早期和孕晚期ICR 小鼠研究，发现以10 个包囊的低数量感染妊娠期小鼠，可以建立弓形虫生殖毒性妊娠期小鼠动物模型，有利于进一步的研究。

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［2］刘媛，谷俊朝.构建弓形虫病动物模型的方法和意义［J］.中国热带医学，2011(8):1028－1030.

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［4］Ajzenberg D，Cogne＇N.Paris L，et al.Genotype of 86 Toxoplasma gondii isolates associated with human congenital toxoplasmosis，and correlation with clinical findings［J］.J Infect Dis，2002(5):684－689.

［5］李亚飞，王寒，潘长旺，等.PRU 株弓形虫包囊感染小鼠模型的建立［J］.中国人兽共患病学报，2010(8):769－771.

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