风湿祛痛胶囊对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及机制

孙璠璠 李 萍 朱志杰 王雨辰 张 月 卢泽原 于晓风 睢大筼

(1 吉林大学药学院药理教研室,长春,132001; 2 通化金马药业集团,通化,134000)



实验研究

风湿祛痛胶囊对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及机制

孙璠璠1李 萍2朱志杰2王雨辰1张 月1卢泽原1于晓风1睢大筼1

(1 吉林大学药学院药理教研室,长春,132001; 2 通化金马药业集团,通化,134000)

目的:研究风湿祛痛胶囊对大鼠佐剂性关节炎(AA)的治疗作用及其可能机制。方法:Wistar大鼠72只,雄性,体重180～220 g,按体重随机分为以下6组:正常组,AA模型组,风湿祛痛胶囊低、中、高剂量(0.25、0.5、1.0 g/kg)组,万通筋骨片阳性药(0.3 g/kg)组。除正常组外,各组大鼠于右后足跖皮下注射0.1 mL弗氏完全佐剂(FCA)制备AA模型。致炎后第2天开始给药,每天灌胃给药1次,连续21 d。测定致炎前及致炎后第2、5、8、12、15、18、21、23 d各大鼠致炎足及对侧足的足跖容积;测定大鼠腹腔巨噬细胞(PMφ)吞噬功能;检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)及白细胞介素6(IL-6)的含量;测定关节渗出液中前列腺素E2(PGE2)的含量;测定血液流变学变化情况。结果:风湿祛痛胶囊能够显著抑制大鼠原发及继发性足跖肿胀,对巨噬细胞吞噬功能、红细胞压积及血沉有明显的抑制作用,能够显著增强血清中SOD活性,降低血清中MDA、NO、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量;明显降低关节渗出液中PGE2的含量。结论:风湿祛痛胶囊对大鼠佐剂性关节炎有显著的改善作用,其机制可能与抑制巨噬细胞吞噬功能、增强机体清除自由基的能力、降低血清中的炎性反应因子水平及改善血液流变学有关。

风湿祛痛胶囊;佐剂性关节炎;大鼠;自由基;炎性反应因子

风湿祛痛胶囊是由川黄柏、苍术、威灵仙等19味中药组成的复方制剂,具有燥湿祛风,活血化瘀,通络止痛功能。用于痹病寒热错杂证,症见肌肉关节疼痛,肿胀,关节活动受限,晨僵,局部发热,风湿性关节炎、类风湿性关节炎见上述证候者。君药黄柏为芸香科植物黄皮树的干燥树皮,其苦寒沉降,清热燥湿,泻火解毒能力强,归肾、膀胱经。现代研究表明[1],黄柏具有抗菌、抗炎、解热、抗癌等多种药理作用,在医药领域有着广泛的应用和开发前景。苍术为菊科苍术属植物,具有化湿运脾作用,用于燥湿健脾,散寒祛风,风湿痹痛及夜盲等病症[2]。威灵仙为毛茛科植物,根部入药用于祛风湿,通经络,消痰涎,散癖积,对全身游走性风湿痛尤其适宜[3]。鸡血藤,为五味子科、菟丝子科、大血藤科、蝶形花科等多种植物的别称,常与地龙、黄芪、当归、丹参等配伍,用于治疗风湿所致的腰膝关节疼痛、风湿痹痛、肢体麻木[4]等。目前尚未见风湿祛痛胶囊对佐剂性关节炎治疗作用的实验研究报道。本文通过建立AA模型,观察风湿祛痛胶囊对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及潜在机制,为其临床应用提供实验依据。

1 材料及方法

1.1 主要试剂 风湿祛痛胶囊,由通化金马药业集团股份有限公司提供,批号:20140601;万通筋骨片,规格:0.28 g/片,由通化万通药业股份有限公司生产,批号:140509H;佐剂用卡介苗,规格:60 mg/支,由中国药品生物制品检定所生产,批号:201301;SOD、NO测定试剂盒,由南京建成生物研究所提供,生产批号:20140909;MDA测试盒,由南京建成生物研究所生产,批号:20140915;IL-1β、TNF、IL-6测定试剂盒,由北京康源瑞德生物技术有限公司生产,批号:20140925。

1.2 大鼠AA模型的建立 制备FCA[5]:取10 mL熔化的无水羊毛脂与20 mL液体石蜡混合后共研磨1 h,经30 min高压灭菌后即得弗氏不完全佐剂(FIA),置于4 ℃保存备用。临用前取10.5 mLFIA于研钵中,将180 mg卡介苗(4.5 mL注射用水溶解)缓慢匀速滴入研钵,边研边滴,按同一方向与FIA共研磨约1.5 h,即制为弗氏完全佐剂,备用。正常组大鼠不做任何处理,其余大鼠于右后足跖皮下注射FCA 0.1 mL制备AA模型[6]。

1.3 动物分组及给药 雄性Wistar大鼠72只,体重180～200 g,按体重随机分为6组:正常(0.5%羧甲基纤维素钠10 mL/kg)组,模型(0.5%羧甲基纤维素钠10 mL/kg)组,风湿祛痛胶囊低、中、高剂量(0.25、0.5、1.0 g/kg)组,万通筋骨片阳性药(0.3 g/kg)组。造模后第2天开始灌胃给药,1次/d,连续21 d。

1.4 测定足跖肿胀程度 于造模前及造模后第2、5、8、12、15、18、21、23 d测定大鼠左、右足跖容积,计算足跖肿胀率[7]。足跖肿胀率(%)=(致炎前足容积-致炎前足容积)/致炎前足容积×100%

1.5 测定腹腔巨噬细胞(PMφ)吞噬功能 造模后第24天,用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,消毒腹部皮肤后向腹腔内注射15 mL含肝素预冷PBS灌洗,取8 mL腹腔液,离心(1 500 r/min,10 min)后弃上清,用预冷的PBS洗细胞2次后将细胞浓度调节至2.5×106/mL,以100 μL/孔加到96孔板中于培养箱孵育24 h,弃去上清液后以每孔100 μL加入0.075%中性红染液,孵育15 min后弃去上清,温PBS洗2次细胞,加巨噬细胞裂解液作用于4 ℃过夜。波长530 nm下用酶标仪测定吸光度[8]。

1.6 测定血液流变学指标 取1 mL已抗凝血加入压积管中,放置离心机3 500 r/min离心30 min,计算红细胞压积。另取已抗凝血1.5 mL测定1 h、2 h血沉率。

1.7 测定相关生化指标 取血于室温静置后离心(2 000 r/min,10 min),分离血清于-80 ℃下保存备用。用生化试剂盒测定SOD活性,MDA及NO含量;用放射性免疫分析测定盒测定TNF-α、IL-1β及IL-6含量[9]。

1.8 关节浸出液中PGE2的含量测定 大鼠炎性肿胀足剪碎后浸泡于5 mL生理盐水中约1 h后离心(2 500 r/min,10 min),取上清液0.3 mL,加2 Ml KOH-甲醇溶液(0.5 mmoL/L)于50 ℃下作用20 min,用甲醇将溶液体积加至20 mL。用紫外分光光度计测定吸光度(波长278 nm)。PGE2的含量表示为每克炎性组织的吸光度值[10]。

2 结果

2.1 风湿祛痛胶囊对足跖肿胀程度的影响 模型组大鼠左、右足肿胀率均显著增高,与正常组比较,差异具有统计学意义(P<0.01～P<0.001)。风湿祛痛胶囊0.5 g/kg、1.0 g/kg于给药后第6、10、13、16、19、21 d均可使大鼠右侧足肿胀显著降低,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05),0.25 g/kg于给药后第21 d可显著降低右侧足肿胀(P<0.05);风湿祛痛胶囊1.0 g/kg于给药后第10、13、16、19、21 d显著降低左侧足肿胀(P<0.05),0.5 g/kg于给药后第16、19、21 d显著降低左侧足肿胀(P<0.05),0.25 g/kg剂量对左侧足肿胀无显著影响(P>0.05),见表1、表2。

表1 风湿祛痛胶囊对右侧原发性足肿胀的影响

注:与正常组相比，△P<0.001;与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

表2 风湿祛痛胶囊对左侧继发性足肿胀的影响

注:与正常组比较，△P<0.01，△△P<0.001;与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表3 风湿祛痛胶囊对血清MDA含量及SOD活性的影响

注:与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 风湿祛痛胶囊对巨噬细胞噬功能的影响 模型组巨噬细胞吞噬功能明显增强,与正常组比较差异具有统计学意义(P<0.05),风湿祛痛胶囊0.25、0.5、1.0 g/kg均可使巨噬细胞吞噬功能明显降低,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05),与阳性药万通筋骨片作用强度相似,见图1。

图1 风湿祛痛胶囊对巨噬细胞吞噬功能的影响

注:与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05

2.3 风湿祛痛胶囊对PGE2在关节渗出液的含量影响 模型组大鼠关节渗出液中PGE2含量显著升高,与正常组比较差异具有统计学意义(P<0.05),风湿祛痛胶囊0.5、1.0 g/kg可显著降低PGE2含量,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05),0.25 g/kg对PGE2含量无明显影响(P>0.05),见图2。

图2 风湿祛痛胶囊对关节渗出液中PGE2含量的影响

注：与正常组比较，#P<0.01;与模型组比较，*P<0.05

2.4 风湿祛痛胶囊对血液流变学的影响 模型组红细胞压积及血沉均显著升高,与正常比较差异具有统计学意义(P<0.05),风湿祛痛胶囊1.0 g/kg能显著抑制红细胞压积,并使1 h及2 h血沉显著下降,与模型组比较具有统计学意义(P<0.05),0.5 g/kg剂量能够显著降低1h血沉,但对红细胞压积及2 h血沉均无显著影响,0.25 g/kg对红细胞压积及1 h、2 h血沉均无明显影响(P>0.05),图3及图4。

表4 风湿祛痛胶囊对血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6含量的影响

2.5 风湿祛痛胶囊对血清MDA含量及SOD活性的影响 模型组血清MDA含量明显增加,SOD活性明显降低,与正常组比较差异具有统计学意义(P<0.01),风湿祛痛胶囊0.5、1.0 g/kg均可明显降低血清中MDA含量,升高SOD活性,且与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05),0.25 g/kg可使SOD活性升高(P<0.05),但对MDA含量无明显影响(P>0.05),见表3。

图3 风湿祛痛胶囊对红细胞压积的影响

注：与正常组比较，#P<0.05;与模型组比较，*P<0.05

图4 风湿祛痛胶囊对血沉的影响

注：与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05

2.6 风湿祛痛胶囊对血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6含量影响 模型组血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6含量均明显增加,与正常组比较差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.01),相比于模型组,风湿祛痛胶囊1.0 g/kg可使血清NO、IL-1β、TNF-α及IL-6的含量显著升高(P<0.05或P<0.01),0.5 g/kg可明显降低血清中IL-1β、TNF-α的含量(P<0.01),但对NO、IL-6均无明显影响(P>0.05);0.25 g/kg可明显降低血清中TNF-α的含量(P<0.05),对NO、IL-1β、IL-6均无明显影响(P>0.05)。见表4。

3 讨论

大鼠佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis,AA)模型在临床表现、病理学、免疫学改变和病理机制等方面与人风湿性关节炎有许多相似特征,是研究风湿性关节炎病理机制和评价治疗该疾病药物的较理想动物模型[6]。本研究通过建立大鼠AA模型,详细描述了大鼠AA模型的炎性反应表现特征,以及对与疾病过程相关因子进行了测定。

风湿性关节炎是一种常见的慢性、复发性的自身免疫性疾病,常表现为滑膜组织增生,血管生成,软骨损毁,骨破坏及关节功能性残疾。这种系统性疾病是由关节组织持续发炎引起的,进而产生疼痛、僵硬、肿胀及其他多种症状[11]。风湿性关节炎在全世界范围内普遍流行,导致长期残疾甚至过早死亡,严重影响人类生活质量。因此,继续对该病进行病理生理性及药理学研究,寻找新型治疗药物显得尤为重要。通常情况下,临床上治疗风湿性关节炎采用非甾体类的化学合成药物,例如布洛芬,醋氯芬酸及萘普生,同时配合甾体类激素如可的松和泼尼松。然而,这些药物仅能暂时缓解炎性反应,减轻症状,对疾病的长期治疗效果并不明显[12]。而且,在疾病的治疗过程中,由于严重的不良反应如胃肠道溃疡、心血管并发症、血液毒性及肾衰竭等的影响,许多患者对药物不再产生任何反应或者不得不被强制终止治疗,因此,采用这类药物治疗风湿性关节炎的成效是极有限的[13]。由于这些药物的治疗缺点,寻找新的高效、低毒抗风湿性关节炎药物成为亟待解决的难题。本研究采用大鼠AA模型,研究风湿祛痛胶囊治疗风湿性关节炎的效果及病理机制,结果表明,风湿祛痛胶囊能使大鼠佐剂性关节炎的关节肿胀程度,显著抑制腹腔巨噬细胞的活化,降低红细胞压积及血沉,显著降低关节渗出液中PGE2含量,能够使血清中MDA、NO、IL-1β、IL-6及TNF-α含量显著降低,显著升高血清SOD活性。

本试验证明,风湿祛痛胶囊具有良好的抗风湿性关节炎的作用,该作用机制主要与其能够抑制巨噬细胞活化,降低血清中的炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量,提高机体清除氧自由基的能力以及改善机体血液流变学性质等因素有关。

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(2015-08-31收稿 责任编辑：王明)

Efficacy and Mechanism of Fengshi Qutong Capsule on Adjuvant Arthritis Rats

Sun Fanfan1, Li Ping2, Zhu Zhijie2, Wang Yuchen1, Zhang Yue1, Lu Zeyuan1, Yu Xiaofeng1, Sui Dayun1

(1DepartmentofPharmacology,SchoolofPharmacy,JilinUniversity,Changchun130021，China; 2TongHuaGolden-horseGroup,TongHua134000，China)

Objective:To observe the efficacy of Fengshi Qutong Capsule on adjuvant-induced arthritis (AA) rats and its possible mechanism.Methods:Male Wistar rats (weighing 180～220 g), with the amount of 72, were divided into six groups randomly: control group, AA group, low, medium, high doses (0.25, 0.5, 1.0 g/kg) of Fengshi Qutong Capsule groups as well as Wantong Jingu Pill (0.3 g/kg) positive control group. Except for the control group, the arthritis was induced by a single injection of 0.1 mL of Freund`s complete adjuvant(FCA) into the palmer subcutaneous tissue of the right hind paw. The second day after the onset of arthritis, all the rats were administrated by drugs once per day for 21 days. The swelling symptom of both hind paws on second, 5th, 8th, 12th, 15th, 18th, 21st, 23rd days were examined; arthritis indexes of non-injected paws were assessed; PMφ function was evaluated; the activity of SOD and the contents of MDA, NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 in serum were measured as well as the content of PGE2in tissue fluid and the hemorheology changes.Results:The swelling symptom in right hind paw and left hind paw were significantly relieved among the Fengshi Qutong Capsule groups, the function of PMφ, the hematocrit and erythrocyte sedimentation rate declined significantly; the SOD activity increased while the contents of MDA, NO, TNF-α, IL-1β, IL-6 in serum significantly decreased; and Fengshi Qutong Capsule can also significantly help decrease the content of PGE2in inflammatory tissue fluid. Conclusion:Fengshi Qutong Capsule shows satisfactory therapeutic effects on AA rats, its mechanism may be related to the inhibition of PMφ activation, enhancement of the capability of scavenging free radicals, declination of inflammatory elements' levels and the improvement of the changes of hemorheology.

Fengshi Qutong Capsule; Adjuvant arthiritis; Rats; Free radicals; Inflammatory factors

吉林省创新型科技企业项目(编号:20130306048HJ)

睢大筼(1957—),男,吉林长春人,教授,博士生导师,主要从事心血管药理研究,Tel：(0431)85619705，E-mail：suidy@jlu.edu.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.12.025