女贞子对大鼠肝组织DAPK基因mRNA表达量的影响*

★ 嵇琴 朱卫丰 张敏 孙振 章明 彭淑红（.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌330004；.江西中医药大学生命科学学院 南昌330004；3.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心 南昌330004）

女贞子为木犀科植物女贞（Ligustum lucidum Ait）的干燥成熟果实。其性凉。《本草纲目》记载具有养阴气，平肝火的作用。很多研究结果都表明寒凉药能抑制能量代谢[1-3]。线粒体是机体能量代谢的主要部位，是能量ATP的生成、利用及产热作用发挥的主要场所。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）基因在线粒体中作为一种线粒体膜电位（Δψm）的传感器存在，线粒体呼吸链抑制将导致膜电位减少，进而诱导DAPK激活和DAPK脱磷酸化[4]。DAPK是1995年由Kimchi及其同事在研究功能性基因克隆中首先发现的[5]。近年来，很多学者对DAPK相关进行了较广泛的研究，但没有取得突破性进展。本课题旨在研究DAPK的mRNA表达情况，试探找出女贞子降低能量代谢的作用机制，从而更好指导中药的临床运用，进一步为药性的科学评价奠定基础，也可对疾病发生的可能性及危害做出预测，以作出早期的预防和指导治疗。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 女贞子购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，产品批号均为：1307007，产于江西。经江西中医药大学邓可众副教授鉴定。RNA保护液购自天根生化科技有限公司（批号：M1705）；RNA提取试剂盒购自Promega公司（批号：20130601）；反转录试剂盒购自Promega公司（批号：000096365）；荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司（批号：AK2901）。所用引物通过引物设计软件oligo 6自行设计，序列如下：内参基因β-actin参照GenBank基因序列（NM_031144）设计，上游引物5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游引物5’TTTAATGTCACGCACGATTTC 3’。DAPK基因参照GenBank基因序列（XM_006253523.1）设计，上游引物：5’AAG ACT GCGGAA GGA CAC 3’，下游引物：5’TAA CAGCCC ACA CTTGAGAG 3’。均由上海生工合成。

1.2 药物制备 药物水提液由本实验室制备。取女贞子药材1.2 kg加入10倍量水，浸泡60 min，于煎药壶中煎药60 min，倒出药液，残渣再加入8倍水，煎煮60 min。合并2次药液，滤过、浓缩后制成含生药量2.9 kg·L-1）（用药前稀释），-20℃放置备用。

1.3 动物 SD大鼠，雄性，200-250g，湖南斯莱克景达实验动物中心提供，许可证号：SCXK（相）2011-0003。给予大鼠标准饲料和饮用水。

1.4 仪器SpectraMax Plus384全波长酶标仪、全自动样品快速研磨仪（上海净信科技，Tissuelyser-24）高速低温离心机（德国SIGMA公司SIGMA3-18K）、荧光定量PCR仪（ABI stepone plus）、电热恒温水浴锅、微量移液器（Eppendorf）、涡旋混匀器、千分之一电子秤。

1.5 动物分组与给药 大鼠30只，随机分为三组，即空白对照组、女贞子低剂量组、女贞子高剂量组，每组10只。各组动物适应性喂养3天后开始灌胃给药，灌胃容积为10mL·kg-1，每日1次，共给药30d。每天给药剂量：女贞子低剂量2g生药·kg-1，女贞子高剂量6g生药·kg-1，空白组给予等容量的蒸馏水。

1.6 试验取材 第31天将大鼠麻醉，取出肝脏后迅速按照顺序分成若干份，提RNA的组织装入RNA保护液中，其余组织分别用锡箔纸包好，迅速放入液氮中，然后转移至-80℃冰箱保存备用。

1.7 SYBR Green实时定量PCR检测DAPK基因的表达[6]

1.7.1 mRNA提取及反转录 取肝脏组织约30～100mg按照Promega RNA提取试剂盒说明书步骤提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，全波长酶标仪测定RNA的纯度和浓度。所提取的RNA-70℃储存备用。按反转录试剂盒说明进行cDNA合成。

1.7.2 DAPK和β-actin扩增效率的检测 首先参照Kenneth的方法[1]，取一份反转录好的肝脏cDNA样品，分别稀释至100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍、1倍。测定每一个稀释倍数下的ΔCT=（CT，target gene-CT，β-actin），然后这些数据经过最小二乘法线性回归分析。

1.7.3 DAPK mRNA的检测 取待测样品的cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作。反应总体积20μL，cDNA为1～2μg，上游引物终浓度为0.5 μM，下游引物终浓度为0.5μM。反应条件为：95℃1 min，95℃15 s及60℃60 s，共40个循环。最后做溶解曲线，以确定扩增产物的特异性。所有样品均重复检测3次，用2-ΔΔCT方法来表示所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因的表达倍数。ΔΔCT=（CT，目的样本target gene-CT，目的β-actin）-（CT，参照样本target gene-CT，参照样本β-actin）。

1.8 统计学方法 采用SPSS16.0进行统计分析。资料经过方差齐性检验，数据用均数±标准差表示。药物组与对照组间的差异比较用独立样本的t检验法。

2 结果

对大鼠肝脏DAPK mRNA表达的影响，与空白组比较，女贞子低剂量组增加了6.4%，无明显统计学意义；女贞子高剂量组增加了91.8%，达到了显著水平（P<0.05）。

3 讨论

本文选择了寒性中药女贞子研究其对肝脏DAPK基因mRNA表达量的影响。中药给药剂量均参考药典剂量范围，DAPK是钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸激酶，检测mRNA表达水平是判断组织表达该基因水平的重要手段之一。mRNA是连接基因与表达产物的桥梁。基因活化的直接结果是mRNA转录增加，而蛋白质的合成有赖于mRNA的翻译，即一种蛋白质分子表达的调控从大体上来讲可分为转录水平和翻译水平。本试验采用Real time-PCR方法分析了女贞子对肝脏组织中DAPK基因mRNA表达的影响。

线粒体呼吸链抑制剂和解偶联剂可以减少线粒体膜电位导致DAPK脱磷酸化和激活，由于DAPK在线粒体中作为一种线粒体膜电位（Δψm）的传感器存在，膜电位减少，DAPK被激活[4]，则其很有可能是通过调节线粒体内膜两侧的电位梯度差，从而影响氧化磷酸化过程。DAPK在正常生理条件下是不活跃的，在本试验中，寒性中药不同剂量女贞不同程度的促进了肝脏DAPK表达量，提示女贞可能通过不同程度的影响膜电位差而促进了DAPK的表达，从而影响了氧化磷酸化而达到抑制能量代谢的作用，这与文献报道寒性药物长期给药后动物产热减少，体温下降也是一致的[7]。

［1］黄丽萍，彭淑红，蒙晓芳，等.6种寒性中药对大鼠肝脏能量代谢的影响［J］.中国中药杂志，2009，34（24）：3 255-3 258.

表1 女贞子对大鼠肝脏DAPK mRNA表达量的影响

［2］彭淑红，黄丽萍，高小恒，等.寒性中药对大鼠骨骼肌能量代谢相关因子的影响［J］.中国中药杂志，2009，34（23）：3 064-3 067.

［3］丁安荣，李淑莉，王奇志.大黄、梔子对小鼠红细胞膜Na~+、K~+-ATP酶活性的影响［J］.中国中药杂志，1990，15（1）：52-57.

［4］Tiesong SS，Joseph J，Hillard CJ，et al.Death-associated protein kinase as a sensor of mitochondrial membrane potential：role of lysosomein mitochondrial toxin-induced cell death［J］.JBiol Chem，2005.280（41）：34 644-34 653.

［5］谢海，仇小强，余红平，等.5-氮杂-2’-脱氧胞苷对人肝癌细胞株SMMC7721增殖及DAPKmRNA表达的影响［J］.广西医科大学学报，2012，29（1）：13-16.

［6］Marcel Kramer，Oliver Backhaus，Philip Rosenstiel，et al.，Analysis of relative gene dosage and expression differences of the paralogs RABL2A and RABL2B by Pyrosequencin g［J］.Gene，2010，455（1-2）：1-7.

［7］陈小野，周永生，樊雅莉，等.大鼠虚寒证模型的研制［J］.中国实验动物学报，2001，9（3）：29-33.