田基黄总黄酮抗CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化的实验研究

王永刚，谭沛，李沛波，徐冰，苏薇薇，陈周全，彭维

（1. 中山大学生命科学大学院，广州现代中药质量研究开发中心，广东省植物资源重点实验室，广州 510275；2. 华润三九医药股份有限公司，深圳 518110）

肝纤维化是机体对物理、化学以及生物方面刺激引起的各种慢性肝损伤的一种修复反应，也是多种慢性肝病的共有病理变化[1]。

田基黄始载于《生草药性备要》，为藤黄科植物地耳草（Hypericum japonicumThunb.）的干燥全草，民间多用其治疗急、慢性肝炎。现代药理研究表明，田基黄具有保肝、抑菌、抗病毒、增强免疫、抑制肿瘤和防治心血管系统疾病等多种药理学作用[2,3]。田基黄化学成分主要为黄酮、间苯三酚类等多种化合物及其衍生物[4]。田基黄总黄酮提取物是我们从中药田基黄中提取的有效部位（黄酮含量大于50%）[5]，目前正在按中药五类新药进行开发。笔者对田基黄总黄酮抗CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化进行了实验研究，现报道如下。

1 材料

1.1 药物及试剂

田基黄总黄酮（黄酮含量为63.5%）：系我们从田基黄中提取分离得到； TBIL、DBIL、ALT、AST、SOD、MDA、GSH-Px、Hyp、GSH检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；大鼠TNF-α ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；HA、LN、PC-Ⅲ放免试剂盒购自上海海军医学研究所生物技术中心；MMP-1 ELISA试剂盒购自上海凯博生化试剂有限公司；TIMP-1ELISA试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司。

1.2 动物

SD大鼠，SPF级，(180～220)g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。

1.3 方法

取SD大鼠，参照文献方法[6]，复制CCl4复合因素致大鼠肝纤维化模型，具体方法为：除正常对照组10只外，其余大鼠第1周（首次）用纯CCl4 5 ml/kg对大鼠背部皮下注射，第2～6周用40% CCl4-橄榄油3 ml/kg 对大鼠背部皮下注射，2次/周。同时第1～6周内，并以20%乙醇作为大鼠的唯一饮水，连续6周。将复制CCl4肝纤维化模型至第6周而存活的大鼠，按性别及体重随机分成4组，每组10只，加上正常对照组，共计5组。然后分别给予药物或蒸馏水：田基黄总黄酮低、中、高剂量组每天分别按9 mg/kg、18 mg/kg、36 mg/kg的剂量灌胃给予田基黄总黄酮1次，连续12周；正常对照组和模型对照组灌服等体积蒸馏水。末次给药1h后，各组大鼠用乙醚轻度麻醉，于腹主动脉采血，取血清采用试剂盒检测TBIL、DBIL、ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ、TNF-α水平；然后打开腹腔迅速取出肝组织并在生理盐水下清洗，匀浆后采用试剂盒检测SOD、MDA、GSH-Px和Hyp，采用ELISA法检测MMP-1和TIMP-1蛋白的表达。

实验数据以“平均值±标准差” 表示，采用的统计软件SPSS 16.0进行统计学分析处理，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）法，P＜0.05 表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 田基黄总黄酮对血清中肝功能指标TBIL、DBIL、ALT、AST的影响

由表1可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST水平均显著升高（P＜0.01），提示该模型大鼠的肝细胞明显破坏。田基黄总黄酮低、中、高剂量组大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST的水平与模型对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01或0.05），说明田基黄总黄酮能降低CCl4复合因素所致肝纤维化大鼠的肝损伤程度。

2.2 田基黄总黄酮对肝纤维化指标PC-Ⅲ、HA、LN、Hyp的影响

由表2可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中PC-Ⅲ、HA、LN含量和肝组织中Hyp含量均显著升高（P＜0.01），提示该模型大鼠具有明显的肝纤维化病理改变。田基黄总黄酮低、中、高剂量组大鼠血清中PC-Ⅲ、HA、LN含量和肝组织中Hyp含量与模型对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01或0.05），提示田基黄总黄酮对CCl4复合因素造成大鼠肝纤维化具有抑制作用。

2.3 田基黄总黄酮对肝组织 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α的影响

由表3可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性显著降低（P＜ 0.01），而MDA含量明显提高（P＜0.01），提示肝纤维化模型大鼠肝脏的抗氧化水平显著降低，氧化损伤明显。此外，可通过多种机制参与肝纤维化过程调控的重要细胞因子TNF-α也显著升高（P＜0.01）。而田基黄总黄酮低、中、高剂量组大鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α与模型对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01或0.05），说明田基黄总黄酮能提高CCl4复合因素造成的肝纤维化模型大鼠肝脏的抗氧化能力，显著降低肝脏的氧化损伤，也能抑制TNF-α的分泌。

表1田基黄总黄酮对血清中肝功能指标TBIL、DBIL、ALT、AST的影响( ±s, n=10)

表2田基黄总黄酮对肝纤维化指标PC-Ⅲ、HA、LN、Hyp的影响( ±s, n=10)

表3田基黄总黄酮对肝组织 SOD、GSH-Px、MDA及血清中TNF-α的影响( ±s, n=10)

2.4 田基黄总黄酮对肝组织MMP-1和TIMP-1蛋白表达的影响

由表4可见，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达显著增加（P＜0.01），而肝组织MMP-1无明显变化（P>0.05），提示肝纤维化模型大鼠肝脏的TIMP-1蛋白表达增加，肝脏中细胞外基质分解减少。而田基黄总黄酮低、中、高剂量组大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达与模型对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01或0.05），说明田基黄总黄酮能抑制CCl4复合因素造成肝纤维化模型大鼠肝脏的TIMP-1蛋白表达，显著促进肝脏中细胞外基质的分解。

表4田基黄总黄酮对肝组织MMP-1和TIMP-1蛋白表达的影响( ±s, n=10)

3 讨论

肝纤维化是是多种慢性肝病的共有病理变化。在各种致病因素作用下，静止期的肝星状细胞（HSC）被激活并增殖、转化为肌成纤维细胞样细胞，其细胞外基质（ECM）的合成和分泌上调，而降解减少，最终导致ECM积聚而发生肝纤维化乃至肝硬化[7]。氧化应激是肝纤维化发生、发展的重要因素之一。多种致肝损伤的因素往往伴随氧化水平的升高或者抗氧化能力的下降，氧化应激与肝纤维化病理机制之间的关系受到越来越多的重视[8]。诸多临床和实验性肝纤维化都被证实与氧化应激有关，使用抗氧化剂有助于减慢或阻止肝纤维化的发展[9～11]。

本实验研究显示，田基黄总黄酮能显著降低CCl4复合因素诱导的肝纤维化大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、PC-Ⅲ、HA、LN的水平、肝组织中Hyp的含量和MMP-1和TIMP-1蛋白的表达，说明田基黄总黄酮具有良好的抗CCl4复合因素诱导的肝纤维化的作用。此外，田基黄总黄酮也能提高肝组织SOD、GSH-Px的活性，降低肝组织MDA及血清中TNF-α的含量，提示田基黄总黄酮抗肝纤维化作用可能与其抗氧化作用及抑制TNF-α的分泌有关。该实验为田基黄总黄酮抗肝纤维化的临床试验提供药理学实验依据。

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