一株聚乳酸降解菌的鉴定

崔 婧 ，时东方，王 强，陈丽娜，陈 珊

(1.长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032；2.东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024)



一株聚乳酸降解菌的鉴定

崔 婧1,2，时东方1，王 强1，陈丽娜1，陈 珊2

(1.长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032；2.东北师范大学生命科学学院，吉林长春 130024)

本文从活性污泥中筛选到一株可以降解PLA的细菌DS04—W，通过形态学、生理生化性质以及16SrDNA序列分析进行菌种鉴定，初步鉴定该菌为Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)，并且具有降解PLA的能力，这为进一步研究酶解PLA的机理奠定了基础。

聚乳酸 ；巨大芽孢杆菌；鉴定

全球经济高速发展的今天，对塑料制品的需求在不断增加，但是一般塑料制品在自然界中很难被降解，所以造成现在“白色污染”越来越严重,破坏了生态平衡，严重威胁人类的健康[1]。近年来人们开始关注可降解塑料,目前已开发的生物可降解塑料主要是聚酯类材料，其中聚乳酸(PLA)以良好的物理化学性能、机械性能及生物相容性受到广泛关注[2]。虽然PLA在很多物理性能和机械性能上优于其他聚酯类材料，但是自然界中发现的能够降解PLA的微生物数量很少，不到0.04%[3-5]。目前为止，人们分离得到能够降解PLA的菌株只有几十种，绝大部分都属于放线菌，包括Amycolatopsis属[6-8]、Saccharothrixwaywayandensis属[9]和Kibdelosporangiumaridum属[10]等，只有少量细菌和真菌可以降解PLA。本实验是从自然界中筛选出一株可以降解PLA的细菌，通过形态学、生理生化性质以及16SrDNA序列分析进行菌种鉴定，并研究其降解PLA的能力，这为进一步研究细菌降解PLA的机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 聚乳酸(PLA)材料

PLA膜和PLA粉末由中国科学院长春应用化学研究所提供，相对分子量2.074 105。

1.1.2 培养基

(1)基本培养基 NaCl 0.1g·L-1，CaCl2·2H2O 0.02g·L-1，FeSO4·7H2O 0.01g·L-1，酵母提取物 0.25g·L-1，(NH4)2SO41g·L-1， MgSO4·7H2O 0.2g·L-1，MnSO40.5mg·L-1， Na2WO40.5mg·L-1， Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1， pH=8.0。

(2)PLA培养基 10ml氯仿中加入0.1gPLA粉末，溶解后，加入0.01g Plysurf A210G和 100ml基本培养基。混匀后用超声波细胞破碎仪处理，工作时间7s，间隔时间6s，处理50次。处理后，将乳化液放在磁力搅拌器上,60℃加热90分钟，蒸去氯仿，最后用基本培养基定容到100ml，得到PLA培养基[12]。

1.2 方法

1.2.1 菌种的分离纯化

取10g活性污泥,接入到以PLA为唯一C源的100ml富集培养基中，在37℃下摇床培养，取1ml的培养液稀释涂布于PLA固体培养基平板上进行分离纯化。

1.2.2 降解PLA膜实验

将PLA膜(1.0cm×1.0cm)灭菌，再放入灭菌的100ml基本培养基中；接入一定量的菌液，在37℃，150r·min-1条件下培养3d。

1.2.3 菌种鉴定

根据《常见细菌鉴定手册》进行形态学和生理生化特性的鉴定[11]。

菌株16S rDNA鉴定及系统发育分析：将细菌的基因组DNA提取，进行PCR扩增，纯化，测序工作由上海生物工程有限公司完成。将菌株的16S rDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对，使用MEGA 3.1软件来构建系统发育树。

1.2.4 PLA降解酶活力的测定

取0.1g·ml-1的PLA乳化液1m,与等体积粗酶液混合，37℃保温24h，然后用L—乳酸试剂盒(南京建成)测定上清中乳酸含量。PLA降解生成乳酸，所以通过计算乳酸生成量来说明PLA降解酶的活力。同时与灭活的酶液做对照[12]。

2 结果与分析

2.1 菌种分离纯化与PLA膜降解能力的测定

从活性污泥中筛选到一株能降解PLA的菌株，命名为DS04—W。该菌对PLA膜具有降解作用，通过扫描电镜观察PLA膜，发现在降解前后PLA膜有显著不同，降解后PLA膜表面凹凸不平，膜上有裂纹出现，透明度下降,并且可以观察到膜的表面有菌生长。

A.PLA膜降解前1000× B.PLA膜降解后2000×

2.2 PLA降解菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

显微镜下观察菌体成短杆状、有芽孢、革兰氏染色为阴性，菌落成透明、圆形、表面光滑隆起状(图2)。

图2 DS04-W菌株的形态观察

2.2.2 生理生化特征

参照《常见细菌鉴定手册》结果，如表1所示。

表1 DS04-W的生理生化性质

注：“-”表示结果为阴性；“+”表示结果为阳性。

2.2.3 16S rDNA 基因序列分析

对菌株的16S rDNA序列进行扩增和测定，得到1514bp核苷酸序列。进行Blast比对，发现与Bacillus sp. 19497和BacillusmegateriumTS IW36 的16S rDNA的同源性为99%。对其进行系统发育分析，构建以16S rDNA序列为基础的系统发育树，如图3所示。

图3 DS04-W 的系统发育树

3 结论

从活性污泥中筛选到一株可以降解PLA的菌株DS04-W，用扫描电镜观察其降解PLA膜的能力，发现降解前后PLA膜有显著变化，证实菌株确实对PLA具有降解能力。

根据《常见细菌系统鉴定手册》,从形态学和生理生化性质上进行鉴定，发现菌株属于芽孢杆菌属，结合16S rDNA序列分析，发现与Bacillus sp. 19497和Bacillus megaterium TS IW36的同源性为99%，因此鉴定菌株DS04-W是Bacillus megaterium(巨大芽孢杆菌)。

[1]K.Madhavan Nampoothiri,Nimisha Rajendran Nair,Rojan Pap-py John.An overview of the recent developments in polylactide(PLA) research[J].Bioresource Technology,2010，101(22)：8493-8501.

[2]Ikura Y,Kudo T.Isolation of a microorganism capable of degrading poly (L-lactide)[J].J Gen Appl Microbiol,1999,45(5):247-251.

[3]Tokiwa Y,Konno M,Nishida H.Isolation of silk degrading microorganisms and its poly(L-lactide) degradability[J].Chem Lett,1999,28(4):355-356.

[4]Jarerat A,okiwa Y Poly(L-lactide) degradation by Saccharothrix waywayandensis[J].Biotechnol Lett,2003，25(5):401-404.

[5]Jarerat A,Pranamuda H,Tokiwa Y.Poly(L-lactide)-degrading activity in various actinomycetes[J].Macromol Biosci,2002,2(9):420-428.

[6]Sakai K,Kawano H,Iwami A,et al.Isolation of a thermophilic poly-L-lactide degrading bacterium from compost and its enzymatic characterization[J].J Biosci Bioeng,2001,92(3):298-300.

[7]Teeraphatpornchai T,Nakajima-Kambe T,Shigeno-Akutsu Y,et al.Isolation and characterization of a bacterium that degrades various polyester-based biodegradable plastics [J].Biotechnol Lett,2003,25(1): 23-28.

[8]Kosuke T,Yutaka K,Kota N.Isolation of Thermophiles Degrading Poly(L-Lactic Acid)[J].J Biosci Bioeng, 1999,87(6):752-755.

[9]Jarerat A,Tokiwa Y.Degradation of Poly(L-lactide) by a Fungus[J].Macromol.Biosci,2001(4):136-140.

[10]John G Holt,Nolel R Krieg,et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology(ninth edition)[M]. London:Batimore phiadelphia honking London munich Sydney tolyo.Wiliams & Wilkins,1994:855-872.

[11]东秀珠,蔡妙莫.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001:128-162.

[12]刘玲绯,李凡,林秀梅,等.1株聚乳酸降解细菌的筛选、鉴定及产酶研究[J].微生物学杂志,2011,31(5):7-13.

Identification of Poly (L-lactic acid) Degrading Microorganism

CUI Jing1,2, SHI Dong-fang1, WANG Qiang1, CHEN Li-na1,CHEN Shan2

(1.Changchun Normal University, Changchun Jilin 130032,China;2.Life Sciences of Northeast University, Changchun Jilin 130024, China)

A strain possessing activity to degrade poly-L-lactic acid (PLA) DS04-W was screened from sludge．It was identified by the analyses of morphological, physiological and biochemical properties, 16SrDNA comparison. It was identified as Bacillus megaterium.Strains DS04′ - W has the ability of degradation PLA. It established the foundation for the further research on enzymic hydrolysis PLA.

Poly (L-lactic acid); Bacillus megaterium;identification

2015-06-27

崔 婧(1986- )，女，吉林长春人，长春师范大学中心实验室助理实验师，硕士，从事生物化学与分子生物学研究。

Q93-331

A

2095-7602(2015)10-0062-04