金昌市副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

潘启敏 孙晓琳

（1.甘肃省金昌市金川区农牧局 甘肃 金昌 737100；2.甘肃农业大学动物医学院 甘肃 兰州 730000）

巴斯德菌科(Past teurel laceae)嗜血杆菌属(Haemophi lus）的副猪嗜血杆菌(H-aemophilus parasuis,Hps)作为猪的上呼吸道条件致病菌所引起的猪的以多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎、高发病率、高死亡率为特征的革拉瑟氏病(Glasser’s disease）对全球养猪业造成严重的威胁[1]。本病已经逐渐演变为世界范围内流行的重要疾病，由于饲养管理条件和环境卫生等因素的影响，金昌市金川区某一大型养殖场也发生了本病。

1 材料与方法

1.1病料来源

金昌市金川区某一大型养殖场共养殖267头猪，于2013年8月21日到8月29，4圈60头的猪舍每圈平均每天发病3只，平均发病率为4.49%，死亡率3.37%。病猪的主要临床症状为：出现咳嗽、呼吸困难、跛行、发病率和死亡率极高，无菌采集病死猪的肺脏、胸腔积液、关节滑液置于灭菌容器中，迅速送实验室并尽快进行病原分离。

1.2培养基

加入5%小牛血清和1%NAD的TSA平板、5%的绵羊鲜血琼脂平板、TSB液体培养。

1.3方法

（1）病原分离：无菌条件下将疑似猪采集的肺脏和关节滑液接种在TSA和血平板上，37℃培养24～48h后挑取大量生长的单个菌落再进行纯培养。

（2）染色镜检：将上述采集的病料组织进行抹片镜检，将纯培养的菌落涂片后进行革兰氏染色，观察细菌的形态。

（3）生化鉴定：无菌条件下挑取可疑单个菌落，划直线接种在无NAD添加的绵羊鲜血平板上，再垂直划线接种金黄色葡萄球菌，37℃培养24～48h观察有无“卫星生长现象”，将生长出来没有溶血的菌落纯培养后接种于各种碳水化合物、尿素酶、糖苷等微型生化鉴定管（杭州天和微生物试剂有限公司）中，37℃培养24～48h观察结果，同时做氧化酶和接触酶实验。

（4）药物敏感实验：将鉴定确认后的副猪嗜血杆菌做37℃液体培养12h，按常规纸片扩散法进行。无菌吸取疑似多杀性巴氏杆菌菌液200μL，用火焰灭菌后的L玻璃棒反复均匀地涂布于TSA培养基上，待干燥后选用CEF、CIP、LEV、ENO、AZM、FLO、TET、TMP、AMX、CEC、TIA、TIL、SPE、PEN、CTX、CHL、STR、KAN、GEN、

ERY等药敏纸片（包含各类抗菌药）等距离(1.5cm)压放在培养基表面。置于37℃培养18～24h取出，观察抑菌圈直径大小并记录结果。判断标准为药物敏感试验抑菌环直径判断标准（WS/T125-1999），即抑菌圈直径小于10mm为耐药，直径在10～15mm为中度敏感，直径大于15mm以上为高度敏感。

2 结果

此次实验总共采集4份组织病料，分离出1株革兰氏阴性丝状杆菌，其细菌学试验结果如下。

2.1菌落和细菌形态：培养后在TSA平板上生长出针尖大小、无色透明、边缘整齐、光滑湿润的小菌落，涂片染色镜检后在显微镜下观察到革兰氏阴性丝状的菌体。

2.2生化实验结果：在绵羊血平板上上划线交叉的地方生长出了一些小菌落，不产生溶血，远离交叉点菌落生长越少，其他生化鉴定的结果见表1。

2.3药物敏感实验结果：药物敏感实验见表2。断方法就是细菌分离鉴定，因为本菌异常脆弱，在外界环境中最多存活24h，因此分离时需要注意病料的新鲜性，本实验分离出的细菌从菌落形态、染色镜检、培养特性、生化实验等方面结果都符合HPS的特性[3,4]。

根据药敏实验的结果显示，此次分离出的副猪嗜血杆菌对庆大霉素、先锋霉素Ⅳ、氨苄舒巴坦、阿米卡星、氯霉素的敏感性较高，根据研究报道HPS对氯霉素的敏感性由2002年的97.3%上升到2008年的100%，该结果可能与氯霉素禁用于动物性食品的国家禁令有关；对恩诺杀星的敏感度较低是由于这种广谱抗生素被不规范的应用于猪病的预防和治疗中。本实验针对多种药物系统的研究了金昌市金川区副猪嗜血杆菌流行菌株的耐药性，为临床用药提供比较详实准确的参考，具有很大的应用意义。在这基础上还是要求持续监测本地区的副猪嗜血杆菌病，实施科学规范的抗生素使用，以防耐药菌株的产生[5]。

3 讨论

副猪嗜血杆菌生长依赖V因子即NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），因此在培养分离时必须添加NAD，细菌在绵羊鲜血平板上生长后不具有溶血性，因此“卫星实验”可作为鉴定的依据[2]。由于其临床症状、病理变化和流行病学特点与链球菌病、支原体肺炎、传染性胸膜肺炎很接近，因此目前比较理想的临床诊

[1]蔡旭旺.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[J].华中农业大学,2006:18-20.

[2]华生,梅书棋,曾德芳等.副猪嗜血杆菌研究进展[J].动物医学进展,2006,27(11):107-110.

[3]吴娟.副猪嗜血杆菌突变株的构建及生物学特性的研究[D].华中农业大学,2006:25.

[4]王平利,梁宏德,陈福伟等.副猪嗜血杆菌感染的病理学观察[J].河南农业科学,2005,12:82-85.

[5]蔡旭旺,陈焕春,刘正飞等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报,2005,24:55-58.