低强度工频磁场对脑片海马区sEPSC发放特性的影响

王金海，杜正高，郑 羽，孔 莹，洪 辉，邱 倩

（1.天津工业大学 电子与信息工程学院，天津300387；2.天津市医学电子诊疗技术工程中心，天津300387）

低强度工频磁场对脑片海马区sEPSC发放特性的影响

王金海1，2，杜正高1，郑 羽1，2，孔 莹1，洪 辉1，邱 倩1

（1.天津工业大学 电子与信息工程学院，天津300387；2.天津市医学电子诊疗技术工程中心，天津300387）

为研究磁场对脑片海马区自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的生物刺激作用，利用实际测量、数学建模和Comsol软件对典型磁刺激装置进行建模与仿真，确定磁场暴露区的磁场强度和分布特性，并采用膜片钳实验对磁场刺激条件下大鼠离体脑片海马区sEPSC进行了研究.结果表明：磁场强度从刺激器舌面处到脑片区衰减125倍左右，且磁场进入溶液后分布更加均匀；磁场强度越高，sEPSC的幅值和频率越低，当磁场强度达到2 mT时，神经元sEPSC的幅值、频率、半波长、上升时间和衰减时间显著下降，说明随磁场磁剂量增加，磁场抑制sEPSC的发放.

工频磁暴露；磁场强度；分布特性；脑片海马区；sEPSC；发放特性

随着科学技术的高速发展和人民生活水平的迅速提高，电力的广泛应用不可避免地引起越来越严重的电磁污染.近年来，人们开始关心这些弥散于我们周围的电磁场会对生物体尤其是人类产生何种影响，对电磁场生物效应的研究得到了各国学者的广泛关注.有研究表明，利用工频磁场对人体的中枢神经系统进行暴露辐射，结果显示人体的学习和预测能力出现下降、反应迟钝等现象[1]；且有报道显示，工频电磁场影响大鼠的空间记忆力[2]和小鸡的迂回学习能力[3].海马区是神经系统中主管学习和记忆的重要区域[4]，例如空间记忆、工作记忆和联系记忆等，临床新生儿的双侧海马损伤会造成严重的学习记忆障碍[5]；海马区还与一些神经疾病有关，报道显示其是阿尔兹海默病、癫痫等精神疾病主要的病变位置[6-7].也有报道显示，30 mT恒定磁场能够明显延长海马区神经细胞的平均存活时间，且平均存活时间是对照组的一倍以上[8].

磁场作为一种物理因素，对运动的带电物质有洛伦兹力的作用.工频磁场刺激是否对细胞间的带电粒子有磁场导向移动作用，从而影响到海马区神经元sEPSC的电生理学特性？另外，研究低强度工频磁场对海马区脑片影响的报道也很少见.基于此，本文提出一种精确计算工频磁场作用于脑片区的磁剂量及其分布特性的研究方案，分析从磁场源到脑片区的磁剂量和分布特性，并讨论在该剂量下工频磁场对大鼠海马区sEPSC发放特性的影响，为揭示工频磁场在海马区的生物效应奠定一定的理论和实验基础.

1 磁场刺激器建模仿真

sEPSC发放特性是衡量大脑海马组织功能强弱的一个重要指标，sEPSC的发放反映海马神经元功能是否正常.通过上文可知，工频磁场对中枢神经及海马区神经细胞具有较大的影响.因此，精确计算作用在脑片上的工频磁场磁剂量对sEPSC的检测具有重要的意义.本节将从实际测量、数学建模及Comsol仿真3个方面对脑片区磁场强度进行建模仿真，考察脑片区的磁场强度和分布特性，保证脑片放置在暴磁区的最佳刺激位置，并从微观上定量确定磁场特性，为后续采用膜片钳技术分析sEPSC的发放特性奠定基础.

1.1 磁场实际测量

本实验自制磁场刺激器，磁路示例及等效电路如图1所示.

图1 实际工频磁路示例及其等效电路Fig.1 Actual circuit and equivalent cicuit

磁路由马蹄形硅钢铁芯载体、培养皿中溶液、铁芯和培养皿间的空气3段材料组成.培养皿玻璃介质相应参数与空气相似，且所占空间很小，基本不影响磁场分布.其具体尺度参数为:铁芯采用冷轧硅钢片，厚2 cm，宽4 cm；线圈由直径0.8 mm漆包铜线绕制，匝数为310匝，舌面积为8 cm2；培养皿为玻璃材质，外壁和底部厚度均为1 mm，培养皿中装有人工脑脊液（arificial cerebrospinal fluid，ACSF）[9].具体材料参数如表1所示.自制圆形线圈外接50 Hz交流稳压电源，可产生0～100 mT交变磁场，通过改变线圈中电流大小，可以调节线圈产生的磁场强度.

表1 材料参数Tab.1 Material parameters

在实际应用工频磁场对脑片区进行磁场刺激时，首先需要通过PF-035型数字特斯拉计测得暴磁区即培养皿处的磁场强度，和实验所需磁场强度进行对比，然后通过调节线圈输入电流大小，得到实验所需磁场刺激强度.当线圈中输入电流分别为0.21、0.32和0.56 A时，测得中心暴露区的磁场大小为0.5、1和2 mT；且通过多点测量证实，在中心暴露区磁场分布基本均匀，满足实验要求.但是，在进行多组试验时，由于每组实验所需的磁场刺激强度是不相同的，通过不断对比磁场强度和调节线圈电流大小来得到所需磁场强度的方法不够严谨，既耗费人力又浪费大量时间.因此，本文尝试采用数学建模的方法，建立线圈电流强度与暴磁区磁场强度之间的关系式，通过确定输入电流的强度，使得暴磁区即培养皿处能够获得所需的磁场强度.

1.2 数学建模

针对如图1所示的磁刺激器，假设磁性材料内磁感应强度是均匀的，其值等于平均半径处的磁感应强度.设磁路平均长度为L，截面积为A，磁导率为μ，若线圈为N匝，有电流I，则外加磁动势为Vm.具体参数为:铁芯磁路长L1=220mm、铁芯和培养皿顶部空气磁路长L2=8mm、培养皿中溶液磁路长L3=32 mm；培养皿、铁芯舌面积和空气截面积分别为A1=7.52π mm2、A2=20×40 mm2、A2.由于培养皿和铁芯之间的缝隙只有4 mm的距离，因此，铁芯中磁感线设定都通过培养皿，这里设定空气截面积和铁芯舌面积相同.

根据磁路的计算原理，外加磁动势Vm为:

磁性材料内的磁通为:

如果磁路由n段组成，则:

式中:Φi为第i段的磁通；Rmi为第i段的磁阻，磁阻计算如下:

式中:R1=L1/u1A2；R2=（L2+L2′）/u2A2；R3=L3/u3A1；L1、L2+L2′、L3分别为铁芯、空气间隙和培养皿溶液中的磁路长度；u1、u2和u3分别为铁芯、空气、溶液中的磁导率；A2和A1分别为铁芯（空气）和溶液的截面积；R1、R2和R3分别为铁芯、空气和溶液中的磁阻.

由式（1）—（4）得培养皿中磁场强度（B）计算公式为:

根据式（5）计算可知，当线圈中分别通入0.083、0.85和1.65 A的电流时，空气间隙中磁场强度为0.5、1和2 mT.

通过数学建模，可以很快获得实验所需的暴磁区磁场强度.但是，该数学模型是以模型中的几何中心线为磁路的，和实际磁路相差明显；模型中没有考虑溶液的浓度、离子密度、电导率等参数，建模得到的结果和实际测量有一定误差.另一方面，实际测量中，由于特斯拉计精确度和灵敏度的限制以及空间上具体测量的难度，磁场分布的均匀性很难测量，数学建模也很难精确地确定磁场分布的情况，而磁场对脑片的刺激是整个区域的刺激，对于磁场均匀性需做进一步研究.因此，本文采用Comsol软件进行进一步建模分析.

1.3 Comsol建模仿真

Comsol Multiphysics是一款强大的有限元法分析软件.研究者可以根据实际情况选择不同的仿真环境和变量值，在结果中可清晰地看到物理场的分布情况.本文所研究的离体脑片及细胞的磁场辐射剂量在几个mT范围内，在磁场刺激的时间段内，溶液的温度热效应忽略不计.在磁场刺激的过程中，脑片存活的环境是人工脑脊液.人工脑脊液和空气的区别在于前者介质为弱导体，对作用到脑片上的磁剂量和分布会产生一定影响，因为其包含生理溶液等因素的干扰，增加了磁场计算的复杂性.Comsol仿真中能够设置溶液电导率、磁导率和密度等实际参数，通过仿真计算得到与实际所需磁场应输入电流大小最接近的电流值，并且从仿真结果中可以看到磁场强度和磁场强弱分布特性.

为精确定量作用于脑片上各点磁场的剂量值，对sEPSC发放特性测量提供精确的磁场刺激环境，本文采用Comsol Multiphysics中的AC/DC模块仿真建模与计算求解.建模时，对磁场刺激器采取1×1的比例建模，设定培养皿中装入空气和ACSF两种不同的材料，材料参数根据实际参数设置，仿真出空气间隙磁场强度的大小和分布特性以及该磁场强度进入溶液中的大小和分布特性，并最终针对孵育环境中脑片上磁场的定量精确分布特性展开研究.当线圈中电流大小分别为0.105、0.20和0.42 A时，经Comsol仿真得到暴磁区磁场强度为0.5、1和2 mT的磁场分布状况，进而确定脑片区的磁场分布特性，结果如图2所示.

图2 脑片区磁场强度的分布图Fig.2 Distribution of magnetic field intensity in brain area

根据离体海马区膜片钳实验，选择溶液中间直径1 cm圆形区为脑片区，由于实验所用的脑片厚度范围在350～500 μm，考虑到溶液中磁场在此厚度内的强度或分布性相差很小，且小尺度模型在Comsol画网格时大大增加了自由度数量，增加求解过程和时间，所以本文采取截面形式进行分析.图上方0.5、1和2 mT数值表示舌面处磁场强度大小.对比图2（a）和图2（b）可以看出，磁场在铁芯舌面处的磁场强度是脑片上磁场强度的125倍左右，且磁场在溶液中分布更加均匀.

2 脑片s EPSC发放特性的测量

膜片钳技术是测量脑片或细胞电生理特性的主要方法，具有高精度高稳定性的特点.本文通过建模仿真得到实验所需的准确磁场刺激强度，在此磁场强度刺激下通过膜片钳技术记录脑片的sEPSC，分析磁场刺激对sEPSC发放特性的影响.

2.1 膜片钳实验

本实验采用中国医学科学院所属放射医学研究所实验动物中心提供的SD（Sprague Dawley）大鼠[11]，鼠龄18～25 d，雄性.并根据文献[12]的方法配置ACSF、切片液和全细胞记录sEPSC电极内液.对大鼠进行断头取脑，置于0～4°C的ACSF中1～2 min，取出后置于震动切片机上切成350 μm厚的脑片.室温下，将脑片放入ACSF中，并通入95%O2+5%CO2混合气体，孵育45 min[13].孵育后，在显微镜下选取活性较好的脑片进行磁场刺激.

准备好磁刺激装置并设定磁刺激器暴磁区的磁场强度（0、0.5、1和2 mT），将培育好的脑片放入培养皿中，并移到刺激器的暴磁区.实验中脑片分为4组，分别是对照组（0 mT）和工频磁场刺激实验组（0.5、1和2 mT），10片一组，每片脑片上取活性最好的4个神经细胞来做实验，每组实验磁场暴露20 min.经过40 d试验后，最终得到142个有sEPSC发放的神经元细胞，本文从中选取122个发放幅值较大的数据进行论述.

在室温下（20～23°C），利用EPC10-USB膜片钳放大器（HEKA，德国）进行全细胞膜片钳记录，通过Pulse软件设定好实验参数、刺激波形及数据采集.采用Minianalysis软件和Origin8.0统计软件分析实验数据.数据经P/N漏减处理后，进行统计与分析，结果用Means±SD表示.差异显著性检验采用单因素方差（one-way ANOVE）分析，post-hoc检验采用Scheffe检验方法进行统计，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001为显著性的3个层次[14].

2.2 脑片sEPSC的发放特性分析

在本文试验条件下，大鼠海马CA1区锥体神经元sEPSC经0、0.5、1和2 mT磁场刺激下的波形如图3所示，其幅值和频率如图4所示.

图3 不同磁场强度刺激后sEPSC的波形Fig.3 Waveform of sEPSC by different magnetic field intensity stimulation

图4 sEPSC的幅值和频率Fig.4 Amplitude and frequeney of sEPSC

由图3和图4可知，在0.5、1、2 mT磁场强度下分别刺激20 min后，大鼠海马CA1区锥体神经元sEPSC发放的幅值和频率均下降；且随磁场剂量增高，sEPSC的幅值和频率降低.由数据分析可知，在0.5 mT磁场刺激下，sEPSC的幅值与正常对照组相比下降2 046.37pA，降幅达到49.8%；而在1和2 mT磁场刺激下，降幅增至80.3%和98%，说明1和2 mT磁场刺激显著抑制sEPSC发放的幅度.在频率发放方面，0.5、1和2 mT磁场刺激下，频率的降幅达到40%、67.3%和75.6%，同样说明工频磁场对海马区CA1区神经元sEPSC的频率发放发挥抑制作用.

根据单因素方差（one-way ANOVE）分析显示，磁场作用明显抑制sEPSC的幅值和频率发放，并且均有显著性差异（F（3，471）=137.32，P＜0.01；F（3，526）=7.031 56，P＜0.05）.2 mT磁场作用下神经元sEPSC的幅值明显低于对照组，通过post-hoc检验表明，2 mT磁场刺激后，对sEPSC幅值和频率的抑制程度尤为显著（F= 73.52，P＜0.001；F=5.85，P＜0.05）.说明磁场已经影响到神经元的活性，导致神经元细胞膜的电生理特性降低.

图5所示为大鼠海马CA1区锥体神经元单个sEPSC的半波宽、上升时间和衰减时间的发放特性.

图5 单个sEPSC半波宽、上升时间和衰减时间的发放特性Fig.5 Issuance characteristics of half-wave w idth,rise time and decay time of single sEPSC

由图5可知，0.5、1、2 mT磁场作用20 min后，大鼠海马CA1区锥体神经元单个sEPSC的半波宽、上升时间和衰减时间的发放特性相似.与对照组相比，0.5和1 mT磁场作用后，sEPSC的半波宽分别上升了0.29和0.64 ms，上升时间分别上升了0.27和0.49 ms，衰减时间上升了0.4和1.0 ms.单因素方差（one-way ANOVE）分析显示，0.5、1 mT磁场作用使sEPSC的半波宽、上升时间和衰减时间显著性增加（F（2，468）= 67.49，P＜0.01；F（2，468）=20.51，P＜0.01；F（2，468）= 87.12，P＜0.01）.由此说明，磁场刺激延长了海马CA1区锥体神经元sEPSC的发放周期，从而降低了其发放频率，说明磁场刺激对脑片sEPSC的频率发放有抑制作用.当增加磁场刺激剂量至2 mT后，与对照组相比，sEPSC的半波宽、上升时间和衰减时间分别下降了0.63、0.79和0.3 ms，降幅达到42.3%、50.3%和23.4%. post-hoc检验表明，与对照组相比，2 mT磁场作用显著抑制了sEPSC半波宽、上升时间和衰减时间的发放（F=13.19，P＜0.001；F=6.71，P＜0.001；F=25.31，P＜0.001）.在2 mT磁场刺激下，脑片上神经元活性下降，细胞膜上离子通道活性随之下降，细胞突触间离子交换能力下降，因此，sEPSC的半波宽、上升时间和衰减时间显著下降，说明2 mT磁场刺激显著抑制了sEPSC的半波宽、上升时间和衰减时间的发放.

综上所述，工频磁场抑制海马区神经元sEPSC的发放特性，且随磁场强度的增加，磁场对sEPSC幅值和频率的抑制越来越强，随之抑制sEPSC半波、上升时间和衰减时间特性.这可能是由于:磁场的洛仑兹力能够影响带电粒子的移动，因此，磁场能够影响细胞膜的离子通透性和膜两侧的电位，导致机体内细胞内外电位失衡，从而影响带电物质的转移过程，产生一些生物效应.另外，在一些生物学的系统里，反磁体分子以高度规则方式排列，并以平行的反磁体矢量连接发挥作用[15].低强度工频磁场产生的洛伦兹力使得突触间带电状态的谷氨酸和Ca2+、Na+、K+等离子非正常移动，不能与突触后膜上相应受体结合，从而影响到sEPSC的放电特性.本实验结果提示，低强度磁场的生物刺激作用与细胞突触膜离子通道特性及通道构形变化有关，但仍需进一步从分子生物学及细胞信号转导方面进行分子层面的理论和实验验证.

3 结束语

为了研究磁场对脑片sEPSC电生理特性的生物刺激作用，本文设计了适用于离体脑片实验的50 Hz、0～100 mT磁信号发生器，通过实际测量、理论公式计算及Comsol建模仿真，得到磁场刺激器暴磁区的磁场强度和分布，最终确定作用到脑片上的磁场强度大小及分布情况.在此基础上，采用全细胞膜片钳技术，针对大鼠海马CA1区的锥体神经元细胞，记录由工频磁场诱发的sEPSC幅值及发放频率，在细胞水平上研究工频磁场对兴奋性突触后电流传递的影响.以sEPSC的幅值、频率、半波长、上升时间和衰减时间为指标，研究工频磁场抑制兴奋性突触传递的可能机制.结果表明:在0.5和1 mT磁场刺激下，神经元sEPSC的频率和幅值均有大幅度的下降，半波长、上升时间和衰减时间均高于未经过磁场刺激的神经元，说明细胞的兴奋性传递频率明显降低；当磁场强度达到2 mT时，神经元sEPSC的幅值、频率、半波长、上升时间和衰减时间显著下降.

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Effects of low intensity power frequency magnetic field on payment feature of hippocampal sEPSC in vitro brain slices

WANG Jin-hai1，2，DU Zheng-gao1，ZHENG Yu1，2，KONG Ying1，HONG Hui1，QIU Qian1
（1.School of Electronics and Information Engineering，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China；2.Center of Tianjin Medical Electronic Engineering Technology，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

In order to investigate the biological stimulation of the magnetic field on the hippocampal spontaneous Excitatory Postsynaptic Current（sEPSC）of the brain slices，the actual measurement，mathematical modeling and Comsol software simulation were used to model and simulate a typical magnetic stimulation device,the magnetic field intensity and distribution characteristics of the exposed area were confirmed.And the hippocampal sEPSC in the vitro brain slices under the magnetic field was studied with the patch clamp experiment.The results showed that the magnetic field intensity decreases by 125 times from the simulator to the brain slice，and the magnetic field distributes uniformly in physiological solution.The higher the magnetic field dose，the lower the amplitude and frequency of sEPSC.When the magnetic field intensity reaches 2 mT，the amplitude，fequency，half-wave width，the rise time and decay time of neuron sEPSC decrease significantly.This results illustrated that with the increase of intensity of magnetic field，the magnetic field suppresses the sEPSC release.

exposure to power frequency magnetic；magnetic field intensity；distribution characteristics；hippocampus in vitro brain slices；spontaneous Excitatory Postsynaptic Current（sEPSC）；payment feature

Q689；TP391.9

A

1671－024X（2015）04－0052－06

10.3969/j.issn.1671-024x.2015.04.011

2015-04-15

国家自然科学基金资助项目（61201106）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201410058027）

王金海（1966—），男，博士，教授，研究方向为生物信息提取.E-mail:wangjinhai@tjpu.edu.cn