基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死的疗效观察*

熊永泉 陆东风 何志裕

随着我国科技及医疗水平的不断发展，细胞性心肌成形术不断发展，已经成为冠心病和心力衰竭治疗、研究的热点，为终末期心脏病患者的治疗带来了新的希望。为进一步研究骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死细胞的治疗作用，本研究以大鼠模型为观察对象进行研究，旨在为临床应用骨髓间充质干细胞移植提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物 选取15 d龄SD乳鼠20只，体质量（210±45） g。

1.2 试剂和仪器 血管内皮生长因子165、磷酸盐、0.2 g/L乙二胺四乙酸、0.5 g/L胰蛋白酶、甲醛（体积分数10%）、小量质粒抽提试剂盒、jet-PEI 细胞转染试剂盒、CM-DiI（Cell TrackerTM C-7001）、DMEM低糖培养基（含10 000u肝素）、HP/Sonos 5 500，7.5 MHz探头、ElivisionTM plus两步试剂盒

1.3 方法

1.3.1 急性心肌梗死动物模型的制备 本研究模型制备的方法为：首先麻醉大鼠，本研究选用的麻醉方式为腹腔注射麻醉，麻醉药选用1%的戊巴比妥钠40~50 mg/kg。麻醉成功后，需气管插管，并连接呼吸机辅助呼吸。前期工作完成后，进入模型制备阶段，助手常规消毒铺单后，由本研究统一研究人员进行手术操作，具体操作步骤如下：首先，于大鼠距胸骨左侧约0.5 cm处沿3、4肋间作纵形切口，逐层剥离后进入胸腔，将心脏充分暴露于手术视野，然后于左心耳下缘与肺动脉圆锥之间距主动脉根部2.0~3.0 mm处，结扎大鼠左冠状动脉前降支，结扎完成后，观察结扎区域是否变白，局部心肌是否运动减弱，以确定是否结扎成功，本研究选用的判定标准为两个以上肢体导联或胸导出现ST段抬高0.2 mV以上。

1.3.2 骨髓间充质干细胞的提取、培养 将大鼠处死后，于无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨，剔除肌肉、骨膜，剪一侧骨端。本研究选用10 mL无血清DMEM低糖培养基（含10 000u肝素）将大鼠股骨和胫骨内的骨髓细胞冲出，将冲出的液体收集后制成单细胞悬液，滤去骨渣及碎肉组织，将剩余液体放置于离心管中，并以1500 r/min的速度，于20 ℃的环境下进行离心，离心时间为5 min，完成后弃上清液，加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM低糖培养基中重悬，然后将细胞悬液注入预先加有密度为1.073的细胞分离液的试管中，并以2000 r/min的速度，于20 ℃的环境下进行离心，离心时间为30 min。离心结束后，取中间的细胞层，再用磷酸盐缓冲液清洗2次后进行原代培养，在培养过程中，观察到骨髓间充质干细胞80%贴满培养瓶底时进行传代消化，本研究采用的方法为：0.2 g/L的乙二胺四乙酸和0.5 g/L的胰蛋白酶按1∶1比例混合进行，传代后继续培养。1.3.3 血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞方法 本研究采用pcDNA3.1（-）/h血管内皮生长因子165对骨髓间充质干细胞进行转染。按上述步骤消化、离心骨髓间充质干细胞后，按105接种于6孔培养板，按jet-PEI试剂盒说明书操作步骤对其进行转染。

1.3.4 骨髓间充质干细胞的标记方法 本研究选用CM-DiI溶液进行标记，运用0.01 mmol/L D-PBS将质量浓度为2 g/L的CM-DiI溶液稀释至2 μmol/L，取生长良好的三、四代细胞，用0.01 mmol/L D-PBS洗涤3次，于37 ℃的环境下加入浓度为2 μmol/L 的CM-DiI，在4 ℃的环境下于体积分数5% CO2的孵箱内孵育15 min。

1.3.5 细胞移植方法 将本研究大鼠分为两组，分别为观察组（血管内皮生长因子组）和对照组（DMEM组），每组10只大鼠。将用CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞进行消化离心，按5×106重悬浮，观察组大鼠在缺血区边缘分4点注射细胞悬液40 μL，对照组大鼠注射无血清DMEM 40 μL，注射部位和方式均与观察组大鼠相同，注射完成后逐层关胸，待大鼠自主呼吸完全恢复后脱机拔管。

1.4 观察指标

1.4.1 大鼠的大体心脏功能 于细胞成功移植后1个月，麻醉大鼠，采用的麻醉方式为腹腔麻醉，麻醉药采用巴比妥钠麻醉，剂量为30 mg/kg，将大鼠仰卧位固定于解剖台，运用HP/Sonos 5 500，7.5 MHz探头检查。计算大鼠左室收缩末期容积和舒张末期容积，并计算出左室射血分数=（左室舒张末期容积-左室收缩末期容积）/左室舒张末期容积。

1.4.2 苏木精-伊红染色 移植后1个月，麻醉大鼠，尾静脉注入高钾液及肝素，迅速取出心脏，PBS漂洗、固定、石蜡包埋、切片、脱水后行苏木精-伊红染色，光镜下观察其病理变化。

1.4.3 新生血管密度 对心脏标本病理切片，行Ⅷ因子染色，每只大鼠取5张切片，分别在每个切片梗死区周边随机选择5个视野，计数毛细血管数目。

1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行分析处理，计量资料用（x-±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠左心室功能比较 观察组与对照组大鼠LVEF分别为（73.45±9.17）%、（43.26±6.33）%，观察组明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 两组大鼠苏木精-伊红染色结果比较 两组大鼠镜下均见左室瘢痕组织形成，有新生血管生成，并出现左室重塑特征，观察组大鼠心脏改变较对照组明显，见图1~2。

图1 观察组大鼠镜下结果

图2 对照组大鼠镜下结果

2.3 两组大鼠血管再生情况比较 观察组大鼠与对照组大鼠血管密度分别为（45.69±4.28）、（17.41±3.67），观察组明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

随着我国科技及医疗水平的不断发展，细胞性心肌成形术不断发展，已经成为冠心病和心力衰竭治疗、研究的热点，为终末期心脏病患者的治疗带来了新的希望[9-11]。骨髓干细胞移植的优势在于其取材简便，从自体采集，避免了胚胎干细胞所面临的伦理学纠纷和免疫排斥反应，且可形成有效的电—机械耦联，弥补了骨骼肌干细胞的不足，因此骨髓干细胞是最具优势的移植细胞来源[12-13]。

本研究运用血管内皮生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植对急性心肌缺血大鼠进行干预，结果显示：观察组大鼠左心室功能、血管再生情况、镜下左心室病理改变均明显优于对照组，提示，骨髓干细胞移植的有效性。血管内皮生长因子是一种最重要的成血管因子，其主要作用在于调节内皮细胞外基质溶解、迁移、增生和管腔形成、刺激多种细胞增殖，延缓衰老，抑制凋亡，改善存活等，促进血管生成[14]。

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