食品中肉类成分的法医学种属鉴别方法

辛彩蕊

一、形态学方法①参见Cattaneo C,DiMartino S,Scali S,Craig O E,Grandi M,Sokol R J.Determining the human origin of fragments of burnt bone: a comparative study of histological, immunological and DNA techniques, Forensic Science International, 1999, 1022-3;Folin M,Contiero E.Electrophoretic analysis of non-human primates hair keratin, Forensic science international, 1996,83:191-199; Kazuhiko Imaizumi,Kei Saitoh,Kazumasa Sekiguchi,Mineo Yoshino.Identification of fragmented bones based on anthropological and DNA analyses: case report, Legal Medicine, 2002, 4:251-256; Owsley D W,Mires A M,Keith M S.Case involving differentiation of deer and human bone fragments, Journal of Forensic Sciences, 1985, 30（2）:572-578.

形态学方法是法医学中最早应用于种属鉴定的方法，主要根据大体和显微镜下的形态、结构差异对检材的种属予以鉴别，如根据肉质的鲜嫩程度、肌肉纤维的粗细、显微镜下红细胞的形态差异来进行鉴别。运用此方法进行种属鉴别，检材范围受限，以骨骼、毛发多见；对于血液样本往往只能区分鸟类和人类，且鉴定结论受鉴定人主观因素影响较大；而对于微量、腐败、加工过的食品则无法进行有效、准确的种属鉴别，因此在公安实践中运用有一定的局限性。

二、血清学方法②参见Takashi Kitao, Satoru Miyaishi, Hideo Ishizu.Identification of human skeletal muscle from a tissue fragment by detection of human myoglobin using a double-sandwich ELISA, Forensic Science International, 1995, 71: 205-214; Takashi Kitao,Satoru Miyaishi,Yuji Yamamoto, Hideo Ishizu.Identification of human skin from a tissue fragment by detection of squamous cell carcinoma-related antigen using an enzyme immunoassay, Forensic Science International, 1996,83:81-86.

血清学方法和形态学方法都是经典的种属鉴别方法，血清学具体方法主要有：凝集反应、沉淀反应、酶联免疫吸附试验(ELISA)、纤维蛋白溶解实验、等点聚焦等。近年来ELISA 法在食品安全领域中的应用大多集中在对微生物的检测。当下在美国通过FDA 认证的、用于检测转基因玉米的EnviroLogix ELISA 试剂盒就是以ELISA 法为核心技术的研发产品。由于血清学方法主要通过检测检材中的种属特异性蛋白来区分，因此对检材的要求较高，对于经过腌制、高温烘烤、蒸煮加热加工或是污染、降解的肉类食品鉴定起来有一定难度，加之其可检测时限短，对法医学的部分检材往往不能成功进行种属鉴别。

三、DNA分析法

与蛋白质相比较而言，DNA 分子具有诸多优点：相对稳定，特异性好，灵敏度高，对于微量的检材也能成功进行分析、鉴别。因此，DNA分析法成为了近年来我国公安机关进行肉类食品种属鉴别的研究热点和核心方法。根据文献报道，核DNA 和线粒体DNA 都是食品中肉类成分种属鉴别的目的基因。由于线粒体DNA 比核DNA 的集聚突变速度快10 倍，更容易区分不同的物种，因此在种属鉴别领域具有无可比拟的优势。目前，线粒体DNA 已成为了种属鉴别的研究重点和核心。

DNA 的高温热稳定性、存在于所有组织和不随基因编码变化的特点使其在检测方面胜过蛋白质。近年来，随着分子生物学突飞猛进的发展，尤其是聚合酶链反应 （Polymerase chain reaction， PCR）技术的出现和广泛使用，为我们以核酸检测为基础进行食品中肉类成分的种属鉴别提供了有效的手段。纵观肉类食品种属鉴别的DNA 分析方法，基本上大部分都是以PCR 技术为核心，并在该技术的基础上发展起来的衍生技术。

（一）PCR技术

1985年问世的PCR 技术在分子生物学领域具有划时代意义，使人们对于微量检材的体外无限扩增核酸片段的愿望成为了现实。PCR 是一种用于体外放大扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，多次重复循环，在短时间内使目的基因片段成指数级倍数增长。显而易见，PCR 最大特点就是能使微量的DNA 大幅增加，以进一步实现对微量检材的DNA 分析。以PCR 为核心的肉制品种属鉴别技术的原理是：根据肉类食品的基因序列设计特异性引物，通过PCR 技术实现目标基因片段的指数级增长，然后通过电泳或是荧光检测技术对食品中肉类成分的种属进行鉴别。

（二）PCR-RFLP技术

限制性片段长度多态性（restrictionfragment length polymorphism，缩写 RFLP）作为第一代DNA 分子标记技术，利用限制性内切酶能识别并切割基因序列，并在特定序列处消化切割DNA 分子，从而产生限制性片段的特性。PCR-RFLP 技术，就是首先对目的基因进行PCR 扩增，再经特异性限制性内切酶酶切，产生特异性的DNA 片段。然后再根据DNA 上已知的酶切位点和预期的酶切结果，与DNA分子量DNA Marker 对比，判断酶切是否成功。由于检材的种属来源不同，导致各种动物的酶切位点不同，因此酶切片段的数量和长度不相同，可根据此差别来对肉制品的种属进行鉴别。Girish①Girish P S.Anjaneyulu A S R,Viswas,et al.Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) of mitochondrial 12SrRNA gene, Meat Science.2005,70:107-112.等学者分别运用四种限制性内切酶AluⅠ、HhaⅠ、ApoⅠ和BspTⅠ对山羊、绵羊、牛、水牛的PCR 扩增产物进行酶切，并根据其酶切片段的差异鉴别出 4 种不同动物的种属来源。Wolf②Wolf C,Rentsch J,Hübner P.PCR-RFLP analysis of mitochondrial DNA: a reliable method for species identification,Journal of agricultural and food chemistry,1999,47（4）:1350-355.等使用三种限制性内切酶AluⅠ、RsaⅠ、HinⅡ对野猪、梅花鹿、等25 种野生动物进行酶切，结果发现即使是亲缘关系较近的物种也可以被成功地鉴别出来。

（三）电泳

电泳技术就是在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。常用的凝胶电泳有两大类，即琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。在肉制品的种属鉴定中，常常对目的基因的扩增产物或是酶切产物进行电泳，再根据电泳谱带对检材进行种属鉴别。林子清①林子清等：《采用PCR-RFLP 技术鉴别肉类食品种属》，《中国法医学会、公安部物证鉴定中心.全国第九次法医学术交流会论文集》2013年。等人应用PCR-RFLP 和聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的方法，扩增牛、羊、马、驴、猪、狗、猫、鸭、鸡共计9种常见食品的动物肉类线粒体DNA 细胞色素b 基因的DNA 片段，并用限制性内切酶stu-I 和Ssp-I 消化后经电泳分离，结果显示上述9 种被检动物的DNA 谱带均不相同，完全能够准确地区分出每种动物。M.Ali Muhammed②M.Ali Muhammed,B.Sri Charan Bindu,R.Jini,K.V.Harish Prashanth,N.Bhaskar.Evaluation of different DNA extraction methods for the detection of adulteration in raw and processed meat through polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), Journal of Food Science and Technology,2015,521.等人运用PCR-RFLP 方法对脊椎动物的肉制品进行种属鉴别，测试结果表明使用这种方法，即使约1%掺假的情况下对掺假的生肉和熟肉制品加工的混合物依旧可以成功检测肉类成分。

（四）DNA测序技术

基因测序是一种强有力的种属鉴别工具。当检材的动物来源及其特性完全未知时，通常先使用已知的通用引物进行扩增，然后将产物测序后与 GenBank 中的有关序列进行比对，进而确定动物物种。Parson W③ParsonW, PegoraroK,NiederstatterH, et a.l Species identification bymeans of the cytochrome B gene.International Journal of LegalMedicine, 2000, 114: 23-28.等对44 种不同种类（鱼类、哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类）的动物CytB 基因进行了PCR扩增，并对 CytB 基因片段进行测序，通过基因序列的比对分析，从而成功区分个样品的种属来源。Bhawna Dubey④Bhawna Dubey,P.R.Meganathan,Ikramul Haque.DNA mini-barcoding: An approach for forensic identification of some endangered Indian snake species.Forensic Science International: Genetics,2010,53:.等人利用DNA 的微型条形码对一些濒危的印度蛇种进行了研究,表明了该方法在蛇物种鉴定中的有效性。但是，基因测序的开展需要高度专业的设备和试剂，操作复杂，耗时长，还必须由技术熟练的专业人员完成，因此在公安实际工作中受到了一定的限制。

综上所述，目前食品中肉类成分种属鉴别方法的研究主要集中在DNA 分析层面，今后随着分子生物学技术的飞速发展，人类或许能够探索、研发出可以在现场快速进行种属鉴别的更可靠方法。