miRNA let-7b修饰的骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脊髓NF-200、GFAP表达的影响

徐玉生，崔 浩，张 松，王培松，朱海洋，钟 斌，苗金红

1)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

miRNA let-7b修饰的骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脊髓NF-200、GFAP表达的影响

徐玉生1)△，崔 浩1)，张 松1)，王培松1)，朱海洋1)，钟 斌1)，苗金红2)

1)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

△男，1969年3月生，博士，副主任医师，副教授，研究方向：骨科疾病的基础与临床，E-mail：ysxu@zzu.edn.cn

miRNA let-7b；骨髓间充质干细胞；脊髓损伤；细胞移植；大鼠

目的：通过观察miRNA let-7b修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对脊髓损伤大鼠的运动功能恢复的作用，探讨miRNA let-7b在损伤脊髓修复中的作用和机制。方法：60只成年SD大鼠分为对照组、BMSCs组、miRNA组，每组20只。采用改良Allen′s法制备脊髓损伤模型。造模后1周， BMSCs组行BMSCs移植，miRNA组移植miRNA let-7b慢病毒载体感染的BMSCs，对照组注射生理盐水。移植后第3天至8周，按BBB标准量表对大鼠后肢运动功能进行评分，用免疫组化方法检测脊髓中神经丝蛋白-200(NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果：实验时间内，各组大鼠BBB评分和脊髓NF-200表达持续升高；不同时间点BBB评分和脊髓NF-200表达以miRNA组最高，BMSCs组次之，对照组最低(P<0.05)。移植后各组脊髓GFAP表达均呈持续性增高，各时间点GFAP阳性表达面积以对照组最大，BMSCs次之，miRNA组最小(P<0.05)。结论：miRNA let-7b可能通过促进BMSCs分化为神经元样细胞、抑制脊髓损伤后反应性胶质细胞的增生及胶质瘢痕形成等机制促进损伤后的神经功能恢复。

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病,常引起损伤节段以下肢体严重的功能障碍。随着细胞技术的发展，外源性干细胞移植为脊髓损伤的治疗提供了一种可能的方法。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)有较强的自我更新和增殖能力，有望成为治疗脊髓损伤的“种子细胞”[1]。但由于移植后的BMSCs在宿主体内成活率及转化率较低，其应用受到很大的限制。 miRNA是一类高度保守的非编码小RNA分子，在生物体内广泛存在，对真核生物的基因表达、细胞周期调控和个体发育等均有影响[2-6]。该实验初步探讨了miRNA let-7b修饰的BMSCs移植修复脊髓损伤的效果和可能机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级成年雌性SD大鼠60只，体重(230±20) g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002。实验前适应性饲养1周，自由饮食。采用随机数字表法分为对照组、BMSCs组、miRNA组，每组20只。

1.2 主要试剂 miRNA let-7b慢病毒载体及阴性对照慢病毒载体由郑州大学第一附属医院神经内科贾延劼教授惠赠，神经丝蛋白-200(NF-200)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB试剂盒均购自北京博奥森有限公司。

1.3 脊髓损伤模型的建立 100 g/L的水合氯醛腹腔注射(300 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉成功后，大鼠取俯卧位固定于实验台上，术区备皮、消毒铺巾后，取背部正中切口，以胸12为中心显露硬膜，于其上放置一长方形塑料垫片(约4 mm×5 mm)，用改良Allen′s法[7-8]以5 g×10 cm的力度撞击脊髓。造模后大鼠出现双后肢回缩样扑动、尾巴痉挛性摆动，局部脊髓充血水肿，BBB评分小于8分，即认为造模成功。生理盐水冲洗后，再次消毒缝皮。术后1周内每天给予青霉素20万U/kg腹腔注射，术后每天给予人工辅助排尿2次。

1.4 干预方法 取传代5次以上的大鼠BMSCs，接种到24孔板上(细胞密度约2×106mL-1)培养48 h。将含miRNA let-7b的慢病毒载体上清加入培养基中，感染复数为20，置于培养箱中孵育。同法制备阴性对照慢病毒载体感染的BMSCs。造模成功后1周，BMSCs组在损伤部位注射10 μL阴性对照慢病毒载体感染的大鼠BMSCs(细胞悬液密度为107mL-1)，注射时进针方向与脊髓呈45°角，针头指向损伤部位中央，进针深度约为2 mm。同法miRNA组在损伤部位注射10 μL miRNA let-7b慢病毒载体感染的大鼠BMSCs(细胞悬液密度为107mL-1)。对照组仅在损伤部位注射10 μL生理盐水。

1.5 BBB法评估大鼠后肢运动功能的恢复情况 各组分别于细胞移植后第3天、1周、2周、4周、8周取4只大鼠，由两人按照BBB评分标准量表进行评分。评分采用双盲法，主要观察大鼠的运动能力、运动协调性和躯体稳定性。后肢无运动功能为0分，运动功能完全正常为21分。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0进行数据分析，3组间BBB评分、NF-200阳性细胞数及GFAP阳性表达面积的比较均采用析因设计的方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 实验动物术后一般情况观察 实验过程中，对照组、BMSCs组各有1只大鼠因麻醉过深死亡被剔除，对照组1只、miRNA组2只因造模失败被剔除，随后在同一时间点通过随机抽样原则补齐动物并重新造模。

造模成功后，3组大鼠均出现严重的双后肢瘫痪及尿潴留，进食及活动情况均较术前减少。随实验进展，3组大鼠活动及进食情况均逐渐好转。细胞移植后3组大鼠BBB评分见表1。

表1 3组大鼠细胞移植后BBB评分比较(n=4)

F组间=28.717，F时间=54.586，F交互=24.865，P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05；#：与BMSCs组比较，P<0.05。

2.2 3组大鼠脊髓组织NF-200的表达 移植后第3天，3组均能观察到少量NF-200表达，以损伤区周围最多。随实验时间进展，3组NF-200阳性细胞均逐渐增多；4周时， miRNA组细胞出现形态学改变，且可见具有典型神经元形态的细胞。见图1、表2。

2.3 3组大鼠脊髓组织GFAP的表达 移植后各时间点，3组均能观察到GFAP表达，且随时间变化其阳性表达面积呈持续性增高。见图2、表3。

图1 细胞移植4周后各组大鼠脊髓NF-200的表达(SABC，×400)

组别移植后第3天移植后1周移植后2周移植后4周移植后8周对照组8.78±0.9112.52±0.8717.26±1.0921.08±1.9629.78±1.04BMSCs组9.78±1.0429.92±2.70*36.03±3.39*44.25±2.98*47.54±1.35*miRNA组9.57±0.8642.69±2.47*#49.22±1.08*#57.47±1.09*#66.00±1.97*#

F组间=1 064.605，F时间=749.806，F交互=66.560，P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05；#：与BMSCs组比较，P<0.05。

图2 细胞移植4周后各组大鼠脊髓GFAP的表达(SABC，×400)

组别移植后第3天移植后1周移植后2周移植后4周移植后8周对照组2496.62±367.134107.93±351.945658.65±550.765818.14±325.795978.39±207.62BMSCs组2237.95±389.143515.56±542.14*4067.34±295.63*4027.93±112.77*3986.96±242.02*miRNA组2047.11±260.732306.41±426.87*#2985.25±274.80*#3145.20±171.90*#3015.83±367.66*#

F组间=187.241，F时间=82.313，F交互=9.994，P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05；#：与BMSCs组比较，P<0.05。

3 讨论

脊髓损伤的治疗主要围绕两个方面：神经细胞的再生和炎症反应的抑制。干细胞移植技术是将具有向成体细胞分化潜能的干细胞(如神经干细胞、BMSCs等)移植到体内，以达到修复或替换受损细胞或组织的目的。BMSCs在特定的微环境下可分化为神经元样细胞[9-11]。另外发现BMSCs不仅能为损伤神经的轴突再生提供基本骨架，而且其分泌的多种神经营养因子参与损伤神经的修复[12-14]。

miRNA作为一种广泛存在的生物体调控物质，在细胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用。Simmons等[15]发现miRNA let-7b以T淋巴细胞白血病同源蛋白和细胞周期蛋白D1为靶点促进BMSCs分化为神经元，通过激活Wnt信号来调控神经干细胞的自我修复和更新。NF是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分，其在维持神经元的功能中起重要作用，且脊髓损伤后NF-200阳性神经元数量及胞体着色程度与后肢功能恢复密切相关[16]。GFAP是构成神经胶质细胞的骨架蛋白，脊髓损伤后期其合成和分泌均大量增加，GFAP的表达水平可以反映星形胶质细胞的功能状态，其大量增生形成的胶质瘢痕可能阻碍神经轴突的生长，抑制损伤神经的修复[17-18]。

该研究中发现3组大鼠NF-200的表达均随实验的进展逐渐增加，且miRNA组在相同时间点均高于BMSCs组和对照组，而GFAP阳性表达面积降低。以上提示miRNA let-7b可能促进BMSCs向神经元分化，分化的神经元大量表达NF-200并减少胶质瘢痕形成，以促进神经恢复。

综上所述，该研究结果表明，miRNA let-7b在BMSCs向神经元细胞的分化过程中起重要调控作用，并通过促进轴突再生抑制胶质瘢痕形成，为损伤神经的恢复提供有利的外环境。但该实验是以动物模型为研究对象，其安全性仍需进一步研究。

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(2014-08-09 收稿 责任编辑姜春霞)

Effects of miRNA let-7b-modified bone mesenchymal stem cells transplantation on expressions of NF-200 and GFAP in rats with spinal cord injury

XUYusheng1),CUIHao1),ZHANGSong1),WANGPeisong1),ZHUHaiyang1),ZHONGBin1),MIAOJinhong2)

1)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

miRNA let-7b;BMSC;spinal cord injury;cell transplantation;rat

Aim: To explore the effects of miRNA let-7b-modified BMSCs transplantation on the repair of nerve in rats with spinal cord injury.Methods: A total of 60 SD rats were randomly divided into 3 groups：control group,BMSCs group, and miRNA group, each group including 20 rats. At 1 week after the spinal cord injury model being established, the control group received physical saline, the BMSCs group was injected with BMSCs,and the miRNA group was treated with BMSCs transfected with miRNA let-7b. The neurological functions were evaluated using the BBB scale after operation.NF-200 and GFAP were detected.Results: After cell transplantation, the BBB scores were the lowest in control group and lower in BMSCs group(P<0.05). After implantation，NF-200-positive cells of miRNA group was much more than the other two groups, while the GFAP positive area was the lowest in miRNA group and lower in BMSCs group(P<0.05).Conclusion: miRNA let-7b may play an important role in the differentiation of BMSCs into neurons, and promote recovery of injured spinal cord through decreasing the formation of glial scar.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.024

R651.2