转染TDP-25对SH-SY5Y细胞自噬蛋白表达及细胞活力、凋亡的影响*

周玉帅，殷竞争，张瑞锋，滕军放#

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

转染TDP-25对SH-SY5Y细胞自噬蛋白表达及细胞活力、凋亡的影响*

周玉帅1,2)，殷竞争1,2)，张瑞锋1,2)，滕军放1,2)#

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

#通信作者，男，1960年11月生，博士，教授，主任医师，研究方向：神经系统退行性疾病，E-mail:13838210077@163.com

TDP-25；自噬；细胞活力；细胞凋亡

目的：探讨TDP-25对SH-SY5Y细胞自噬蛋白表达及细胞活力、凋亡的影响。方法：将神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分为3组，分别转染质粒GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25，24 h后应用免疫荧光法检测包涵体，Western blot法检测LC3、 Beclin-1蛋白的表达情况。将SH-SY5Y细胞转染质粒GFP-TDP-25后分为2组，一组加自噬抑制剂3-MA,一组不加3-MA,MTT比色法检测细胞活力，Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。结果：GFP-N1组细胞胞质、胞核均见较强绿色荧光信号；GFP-TDP-43组较强的绿色荧光信号分布于胞核中，未见明显的包涵体形成；GFP-TDP-25组可见较强的绿色荧光信号颗粒状分布于胞质中，形成包涵体；3组Beclin-1表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ差异有统计学意义(F=192.700、247.420，P<0.05)，GFP-TDP-25组Beclin-1表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ大于GFP-TDP-43组(P<0.05)，后者大于GFP-N1组(P<0.05)。加入3-MA后，转染GFP-TDP-25的细胞细胞活力降低，细胞凋亡率增高(t=38.595、5.920，P<0.001)。结论：TDP-25可能通过上调细胞巨自噬水平减弱其对细胞的损害。调控巨自噬水平对肌萎缩性侧索硬化症和额颞叶变性患者的病情进展可能起到一定的延缓作用。

TDP-43(transactive response DNA-binding protein of 43 000)是一种DNA和RNA结合蛋白，在心脏、肾脏、肌肉和中枢神经系统中广泛表达[1]，结构上含有两个RNA识别基序，N端区域具有核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)，同时N端区域还具有3个Caspase-3水解位点(TDP-43可被水解形成截短型片段)，C末端区域富含甘氨酸序列，介导蛋白间的相互作用[2]。生理状态下TDP-43主要定位于胞核，通过与DNA和RNA结合，参与转录、剪切等过程，也参与细胞凋亡、细胞分裂和神经可塑性的调节等过程[3]。病理状态下，移位至胞质的TDP-43被过磷酸化、泛素化和水解生成保留C末端的截短型片段(TDP-35和TDP-25)，可溶性降低并形成聚集物，丧失功能。Neumann等[4]研究发现肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration，FTLD)患者脑组织中存在TDP-43阳性包涵体，其主要成分为过磷酸化、泛素化TDP-43和TDP-35、TDP-25。自噬(autophagy)作为细胞降解受损细胞器和异常蛋白的途径之一，是否参与TDP-43阳性包涵体的形成，TDP-25是否参与ALS和FTLD的致病过程至今仍不清楚。作者构建了过表达TDP-25的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y模型，观察模型细胞包涵体形成情况、细胞活力和凋亡的变化、自噬蛋白LC3和 Beclin-1的表达情况，探讨TDP-25与自噬的关系，初步探讨ALS和FTLD可能的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SH-SY5Y细胞由中南大学湘雅医院唐北沙教授馈赠；质粒GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25由课题组构建；DMEM高糖培养基及胎牛血清均购自Gibco公司；Lipofectamine®2000转染试剂购自Invitrogen公司；Beclin-1、LC3一抗均购自Abcam公司，GAPDH购自Santa Cruz公司；过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Promega公司；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、噻唑蓝(MTT)均购自Sigma公司。

1.2 细胞培养 将SH-SY5Y细胞培养于含体积分数10%胎牛血清的培养基中，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况，2～3 d传代1次。取对数生长期且状态良好的细胞进行实验。

1.3 细胞中包涵体的检测 调整细胞密度为5×105mL-1，以1.5 mL/孔接种于12孔板，随机分为3组，24 h后脂质体转染法分别转染GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25，转染24 h后每孔用40 g/L多聚甲醛固定10 min，1×PBS漂洗3遍后，应用荧光显微镜(Olympus DP71)在320倍视野下观察，分析荧光情况，抽取10个不相重复的视野拍照。实验重复3次。

1.5 细胞活力的检测 调整细胞密度为5×105mL-1，以0.1 mL/孔接种于96孔板，随机分为2组，每组16个复孔，24 h后转染GFP-TDP-25，转染12 h后一组每孔给予10 mmol/L 3-MA处理(GFP-TDP-25+3-MA组)，另一组不予处理(GFP-TDP-25组)。转染24 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，孵育4 h后弃培养基，加入100 μL二甲基亚砜，选择570 nm波长测定吸光度值，表示细胞活力。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡的检测 调整细胞密度为5×105mL-1，以2 mL/孔接种于6孔板，随机分为2组，分组处理方法同1.5。转染 24 h 后细胞均用0.14 g/L EDTA消化，调整每组细胞密度为5×105mL-1，各取100 μL细胞悬液加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL 20 g/L PI溶液，孵育15 min后上流式细胞仪检测(Ex=488 nm，Em=530 nm)。

1.7 统计学处理 应用SPSS 19.0进行统计学处理，GFP-N1、GFP-TDP-43和GFP-TDP-25组细胞LC3、Beclin-1表达情况的比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25组细胞活力、凋亡率的比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 包涵体检测结果 见图 1。GFP-N1组细胞胞质、胞核均见较强绿色荧光信号；GFP-TDP-43组较强的绿色荧光信号分布于胞核中，未见明显的包涵体形成；GFP-TDP-25组可见较强的绿色荧光信号颗粒状分布于胞质中，形成包涵体。

2.2 GFP-N1、GFP-TDP-43 和GFP-TDP-25组细胞中LC3、 Beclin-1蛋白表达的比较 见图2、表1。GFP-TDP-25组Beclin-1/GAPDH及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ大于GFP-TDP-43组，后者大于GFP-N1组。

组别nLC3-Ⅱ/LC3-ⅠBeclin-1/GAPDHGFP-N1组360.051±0.0090.010±0.005GFP-TDP-43组360.135±0.045*0.016±0.002*GFP-TDP-25组360.326±0.095*#0.040±0.009*#F192.700247.720P<0.001<0.001

*：与GFP-N1组比较，P<0.05；#：与GFP-TDP-43组比较，P<0.05。

2.3 GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25组细胞活力、凋亡率的比较 见表2。

表2 GFP-TDP-25+3-MA和GFP-TDP-25组细胞活力、凋亡率的比较

与GFP-TDP-25组比较，GFP-TDP-25+3-MA组细胞活力降低，而细胞凋亡率增高。

3 讨论

ALS是一种致命的运动神经元疾病，临床表现为进行性肌无力、肌萎缩等，该病无法治愈，患者最终因呼吸衰竭而死亡，从发现临床症状开始，平均生存期为2～4 a[5-6]。在65岁以下的人群中FTLD是第二大常见的痴呆性疾病[7]，其临床表现为行为异常、言语障碍和运动障碍等[8]，绝大多数患者发病年龄在45～65岁，病程2～20 a，平均约8 a，目前无有效的治疗方案[9]。其临床症状和神经系统的病理特点与ALS有一定重叠性，说明ALS和FTLD可能是同一种神经退行性疾病，只是易感神经元不同[10]。Neumann等[4]研究发现，ALS和FTLD患者神经组织中存在TDP-43阳性包涵体，TDP-25为其主要成分，TDP-25的产生机制可能与Caspase-3有关。Zhang等[11]研究发现抑制颗粒蛋白前体基因(PGRN)表达后Caspase-3被激活，TDP-43被水解形成TDP-25。

该实验结果显示，外源性TDP-43并未在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中形成包涵体，TDP-43定位于胞核；而转染TDP-25的细胞形成包涵体，TDP-25分布于胞质；说明TDP-25与包涵体的形成有关。Winton等[12]研究发现TDP-25缺乏NLS，因此无法进入细胞核而聚集于胞质内。有研究[2]发现TDP-25被磷酸化后水溶性降低且具有细胞毒性。Caccamo等[13]研究发现过表达TDP-25可诱导内源性TDP-43于胞质中聚集，随之胞核中的TDP-43水平降低。因此推测包涵体的形成与TDP-25本身易聚集等特点和其对TDP-43的作用有关。

自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，根据底物进入溶酶体途径的不同分为3类：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone -mediated autophagy，CMA)。通常说的自噬是指巨自噬[14-15]。自噬是一种可诱导的过程，病理学损伤和蛋白异常聚集均可上调自噬水平，自噬通过降解异常聚集、错误折叠的蛋白和受损的细胞器等来减轻细胞损害，从而起到保护作用。然而过度的自噬可诱导细胞死亡，即自噬性细胞死亡[16]。LC3、Beclin-1作为巨自噬的分子标记物，已成为检测巨自噬活性的重要方法。Beclin-1和LC3-Ⅱ表达水平高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大，说明巨自噬水平上调，反之说明巨自噬水平下调[17-19]。

该实验结果显示，GFP-TDP-25组细胞Beclin-1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于GFP-TDP-43组和GFP-N1组，说明过表达TDP-25诱导了细胞巨自噬水平。进一步研究发现，与GFP-TDP-25组比较，加入自噬抑制剂 3-MA的GFP-TDP-25+3-MA组细胞凋亡率较增加，细胞活力减弱,说明TDP-25可能通过上调细胞巨自噬水平减弱其对细胞的损害。有研究[13,20]发现自噬参与降解异常的TDP-43、TDP-25，抑制自噬后TDP-25的聚集增加，诱导自噬后可降低TDP-25的聚集和恢复TDP-43的核定位。因此推测，作为一种细胞保护机制，上调巨自噬可能加速清除TDP-43阳性包涵体，从而减轻TDP-25诱导的细胞损害，对ALS和FTLD患者病情进展可能起到一定的延缓作用。

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(2014-10-27 收稿 责任编辑王 曼)

Expression of autophagy proteins and cell vitality,apoptosis of SH-SY5Y cells transfected with TDP-25

ZHOUYushuai1,2)，YINJingzheng1,2)，ZHANGRuifeng1,2)，TENGJunfang1,2)

1)DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince，Zhengzhou450052

TDP-25；autophagy；cell vitality;cell apoptosis

Aim: To investigate the effect of TDP-25 transfection on autophagy,vitality,and apoptosis of SH-SY5Y cells.Methods: The recombinated plasmids GFP-N1,GFP-TDP-43 and GFP-TDP-25 were transfected into SH-SY5Y cells through eukaryotic cell transfection technique for 24 h,then immunofluorescence assay was performed to observe the form of ubiquitinated inclusions(UBIs), and the expressions of LC3 and Beclin-1 were detected using Western blot assay. SH-SY5Y cells were transfected with GFP-TDP-25, and treated with 3-MA,then the cell vitality was measured using MTT, and apoptosis was assayed with flow cytometry. Results:UBIs were localized at the cytoplasm in the cells of GFP-TDP-25 group.There were significant differences in the expression levels of Beclin-1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰamong GFP-N1,GFP-TDP-43 and GFP-TDP-25 groups(F=192.700,247.420，P<0.05), and the expression level of Beclin-1 and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in GFP-TDP-25 group was the highest(P<0.05). Cell vitality of the cells transfected with GFP-TDP-25 and treated with 3-MA was lower and apoptosis rate were higher than cells only transfected with GFP-TDP-25(t=38.595,5.920，P<0.001).Conclusion: TDP-25 might weaken the cell damage through upregulating the level of macroautophagy.It maybe helps to inhibit the progress of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration through a proper regulation of macroautophagy.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.022

*郑州市科技攻关项目 131PLJRC675

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