电烧伤大鼠血清诱导单核细胞分泌VEGF对单核-内皮细胞黏附作用的影响*

阮琼芳， 赵超莉， 叶子青， 谢琼慧， 谢卫国

(武汉大学同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，湖北 武汉 430060)



电烧伤大鼠血清诱导单核细胞分泌VEGF对单核-内皮细胞黏附作用的影响*

阮琼芳， 赵超莉， 叶子青， 谢琼慧， 谢卫国△

(武汉大学同仁医院暨武汉市第三医院烧伤研究所，湖北 武汉 430060)

目的： 观察电烧伤大鼠血清诱导的单核细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的水平，探讨其对单核细胞与血管内皮细胞黏附作用的影响。方法: 制做电烧伤大鼠模型，制备电烧伤大鼠血清，同时制备正常大鼠血清作为对照。采用夹心ELISA法检测正常大鼠血清和电烧伤大鼠血清中VEGF及其可溶性受体sFlt-1含量。按照随机数字表法将人单核细胞株THP-1细胞分为正常血清组和电烧伤血清组，ELISA法检测2组细胞上清液中VEGF和sFlt-1含量。按照随机数字表法将人单核细胞株THP-1细胞分为正常血清组、烧伤血清组、正常血清+阻断剂组和烧伤血清+阻断剂组。取培养3 h、6 h的THP-1细胞，加入单层血管内皮细胞株EA.hy926细胞，行单核-内皮细胞黏附检测。结果: 大鼠电烧伤后血清VEGF水平较正常大鼠显著增加， sFlt-1水平较正常大鼠明显减少。电烧伤血清诱导THP-1细胞分泌VEGF，sFlt-1水平随之减少。电烧伤血清可促进单核细胞与内皮细胞的黏附作用，sFlt-1可抑制电烧伤血清诱导的单核细胞与内皮细胞的黏附作用。结论: 电烧伤大鼠血清诱导单核细胞分泌VEGF,从而促进单核-内皮细胞黏附。阻断VEGF的生物学效应，可有效抑制单核-内皮细胞的黏附。

电烧伤； 单核细胞； 内皮细胞； 黏附作用

过度炎症反应是电烧伤重要的病理生理学改变之一，它是导致和加剧伤后组织进行性坏死的重要原因。单核-内皮细胞黏附是血管炎症反应的始动环节，因此，阐明单核-内皮细胞黏附作用的机制对电烧伤早期过度炎症反应的控制具有重要意义。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)又称血管通透因子(vascular permeabi-lity factor，VPF)，是目前发现的最强的增强血管通透性的物质之一。我们前期研究发现电烧伤早期大量炎症细胞包括单核细胞、巨噬细胞等均高表达VEGF[1]，我们推测VEGF在电烧伤早期血管炎症反应中发挥重要作用。本研究拟采用电烧伤大鼠血清培养人单核细胞株THP-1细胞，初步探讨单核细胞分泌VEGF对单核-内皮细胞黏附作用的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 材料与试剂 DMEM培养液、RPMI- 1640培养液和FBS购自Gibco；大鼠VEGF、大鼠VEGF可溶性受体sFlt-1、人VEGF和人sFlt-1检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；钙黄绿素乙酰甲酯(calcein-AM)购自Sigma；sFlt-1购自R&D。

1.2 细胞 人单核细胞株THP-1细胞购自武汉大学细胞保藏中心，人血管内皮细胞株EA.hy926细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，由武汉大学动物实验中心提供，实验前12 h 禁食，自由饮水。

2 方法

2.1 血清制备 参照文献[2]方法制作电烧伤模型。电烧伤组大鼠以30 g/L戊巴比妥钠按10 mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定于实验台上，在大鼠臀部及右后肢备皮，小电极置于右踝上0.5 cm小腿腹侧皮肤上，大电极置于同侧臀肌处。致伤电压1 kV，电击时间0.1 s，创面面积为0.5 cm×0.5 cm、深达骨骼，无低血容量性休克发生。于电烧伤后1 d处死，取外周静脉血静置 1 h，1 000×g离心10 min，分离血清，即为电烧伤大鼠血清。正常大鼠不作处理，直接取外周静脉血，余处理同前，即为正常大鼠血清。电烧伤血清和大鼠血清均于56 ℃灭活30 min，-80 ℃冻存备用。

2.2 细胞培养及实验分组 将THP-1细胞置于含体积分数10% FBS的RPMI-1640 培养液中，在37 ℃、体积分数5% 的CO2培养箱中培养。取部分THP-1细胞，PBS清洗2次，按照随机数字表法分为正常血清组：将细胞重悬于含体积分数20%正常大鼠血清的RPMI-1640培养液中；电烧伤血清组：将细胞重悬于含体积分数20%电烧伤大鼠血清的RPMI-1640培养液中；细胞浓度均调至1×109/L。加入6孔板中，每组设6个复孔，每孔2 mL，常规条件培养。

2.3 ELISA检测大鼠血清和THP-1细胞培养上清中VEGF和sFlt-1的含量 采用双抗夹心ELISA法测定大鼠血清和THP-1细胞培养上清中VEGF和sFlt-1的含量，操作按说明书进行。采用酶标仪在波长450 nm下测定吸光度值，绘制标准曲线计算含量。

2.4 sFlt-1抑制VEGF生物学活性对单核-内皮细胞黏附作用影响的实验分组及处理 另取部分THP-1细胞，PBS清洗2次，按照随机数字表法分为(1)正常血清组：采用含体积分数20%正常大鼠血清的RPMI-1640培养液培养；(2)电烧伤血清组：采用含体积分数20%电烧伤大鼠血清的RPMI-1640培养液培养；(3)正常血清+阻断剂组：用含100 μg/L sFlt-1和20%正常大鼠血清的RPMI- 1640培养液培养；(4)电烧伤血清+阻断剂组：用含100 μg/L sFlt-1和20%电烧伤大鼠血清的RPMI-1640培养液培养。调整细胞浓度至1×109/L，加入6孔板中，每组设6个复孔，每孔2 mL，置于常规条件培养。

2.5 单核-内皮细胞黏附检测 将EA.hy926细胞置于含体积分数10%FBS的DMEM培养液中，在37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养，隔天换液，细胞生长达90%融合时用2.5 g/L胰蛋白酶进行消化传代，扩增细胞用于后续实验。

采用DMEM培养液将EA.hy926细胞浓度调至1×108/L，加入96孔板，每孔0.2 mL，待细胞完全融合至单层备用。取经上述2.4步骤处理的培养3 h、6 h的THP-1细胞，用calcein-AM进行标记，D-Hanks平衡液洗涤2次，采用RPMI- 1640培养液将细胞浓度调至5×108/L备用。用D-Hanks平衡液洗涤96孔板中铺有EA.hy926细胞的培养孔2次，每孔加入0.2 mL的THP-1细胞，37 ℃孵育30 min，用D-Hanks平衡液小心冲洗掉未黏附的THP-1细胞。置于100倍荧光倒置显微镜下观察，每组设6个复孔，每孔随机选择6个视野，取平均值计算黏附的THP-1细胞数目。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0统计软件处理，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 电烧伤大鼠血清VEGF和sFlt-1含量

大鼠电烧伤后6 h和24 h血清VEGF的水平较正常大鼠显著增加(P<0.01), 血清sFlt-1的水平较正常大鼠明显减少(P<0.01)，见表1。

表1 电烧伤大鼠血清VEGF和sFlt-1的含量

Table 1.VEGF and sFlt-1 concentrations in the serum of rats with electrical burns (Mean±SD.n= 6)

Group VEGF(ng/L)sFlt-1(μg/L)Normal 55.40±5.193.10±0.16Electricalburn(6h)85.80±6.69**2.50±0.16**Electricalburn(24h)164.20±10.61**1.20±0.02**

**P<0.01vsnormal.

2 THP-1细胞上清VEGF和sFlt-1的含量

电烧伤血清组培养3 h、6 h和24 h，THP-1细胞上清中的VEGF水平较正常对照组显著增加(P<0.01)；细胞上清中sFlt-1的水平较正常对照组明显减少(P<0.01)，见表2。

表2 电烧伤血清培养的THP-1细胞上清VEGF和sFlt-1的含量

Table 2.VEGF and sFlt-1 concentrations in supernatants of THP-1 cells cultured with electrical burn serum (Mean±SD.n=6)

Group VEGF(ng/L)sFlt-1(ng/L)Normalserum 129.90±5.02498.00±8.26Electrical3h193.30±7.20**455.90±6.66** burnserum6h274.40±6.36**432.20±5.27** 24h406.20±7.91**392.00±4.58**

**P<0.01vsnormal serum.

3 单核-内皮细胞黏附

与正常血清组比较，电烧伤血清组每100倍视野下与EA.hy926细胞黏附的THP-1细胞数均显著增多(P<0.01)；而电烧伤血清+阻断剂组每100倍视野下与EA.hy926细胞黏附的THP-1细胞数较电烧伤血清组明显减少(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The effect of sFlt-1 on monocyte adhesion cultur with electrical burn serum (×100) . A, E: normal serum; B, F: normal serum+sFlt-1; C, G: electrical burn serum; D, H: electrical burn serum+sFlt-1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal serum.

图1 sFlt-1对电烧伤血清诱导单核-内皮细胞黏附作用的影响

讨 论

VEGF是血管内皮细胞特异的有丝分裂素，其表达可受多个因素调节，其中，缺氧是最强的刺激因子[3]。VEGF可与血管内皮细胞上酪氨酸激酶受体(VEGFR1和VEGFR2)的细胞外结合域结合，进而发挥一系列生物学效应。不同受体各有其不同生物学作用，例如VEGFR1对单核和巨噬细胞的游走有正调节作用，而对VEGFR2的信号传递起着正(负)调控作用，可溶性VEGFR1(sFlt-1)具有与VEGFR细胞外结构域相似的结构，能与VEGF结合，阻断VEGF信号转导通路，是内源性直接靶向VEGF的阻断剂[4-5]。

本研究首先观察电烧伤后大鼠血清VEGF和sFlt-1的水平，结果显示伤后6 h和24 h大鼠血清VEGF的含量较正常大鼠明显增加，血清sFlt-1的含量反之下降。我们推测电烧伤后受伤肢体高度肿胀，组织间压力增高，血管受压导致局部组织缺血缺氧，可能是电烧伤后血清VEGF水平升高的重要原因；伤后sFlt-1的水平下降亦可是导致有生物活性的VEGF的释放量增多的另一个重要因素。

电烧伤血清是电烧伤导致机体病理生理改变的综合体液因素，含氧自由基、炎症介质和多种细胞因子，是引发炎症反应的重要因素。本研究体外实验中，我们采用电烧伤血清培养人单核细胞株THP-1模拟体内微环境对单核细胞的影响，结果显示，电烧伤血清组培养3 h、6 h、24 h THP-1细胞上清液中的VEGF含量随培养时间逐渐增加且均明显高于正常对照组；sFlt-1的变化则相反，其含量随着培养时间的延长而逐渐减少。这一变化结果与伤后大鼠血清VEGF和sFlt-1的改变相同。以上结果提示，VEGF含量增加与sFlt-1的减少密切相关。

我们前期研究结果显示，电烧伤血清可以促进单核-内皮细胞的黏附作用[6]。为了进一步证实单核细胞分泌VEGF参与了单核细胞与内皮细胞的相互作用，笔者采用sFlt-1与电烧伤血清共孵育THP-1细胞，电烧伤血清+sFlt-1组与电烧伤血清组比较，结果显示sFlt-1可有效抑制单核-内皮细胞的相互作用，减少与内皮细胞黏附的单核细胞数。

综上所述，本研究初步证实电烧伤早期单核细胞分泌VEGF可促进单核-内皮细胞的黏附作用，是血管炎症反应的重要始动因素之一；阻断VEGF生物学效应可有效抑制单核-内皮细胞的黏附作用，为电烧伤早期抗炎治疗提供新的治疗思路和靶点。

[1] 阮琼芳，谢卫国，温丰平. 血管内皮生长因子在电烧伤大鼠血清及创面组织中的表达变化[J]. 中华烧伤杂志，2012，28(6):423-427.

[2] 张 伟，谢卫国，赵超莉，等. 大鼠单侧肢体高压电击伤模型的建立[J/CD]. 中华损伤与修复杂志：电子版，2008，3(4):426-432.

[3] Bates DO. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability[J]. Cardiovasc Res, 2010, 87(2):262-271.

[4] Kendall RL, Wang G, Thomas KA. Identification of a natural soluble form of the vascular endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 226(2):324-328.

[5] Barleon B, Sozzani S, Zhou D, et al. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1[J]. Blood, 1996, 87(8):3336-3343.

[6] 阮琼芳，赵超莉，叶子青，等. 电烧伤大鼠血清诱导单核-内皮细胞黏附中的作用[J]. 中华烧伤杂志，2014，30(3):237-242.

Effect of monocyte-secreted VEGF induced by electrical burn serum on monocyte-endothelial cell adhesion

RUAN Qiong-fang, ZHAO Chao-li, YE Zi-qing, XIE Qiong-hui, XIE Wei-guo

(InstitureofBurns,WuhanThirdHospitalandTongrenHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China.E-mail:wgxie@hotmail.com)

AIM: To observe the level of vascular endothelial growth factor (VEGF) secreted by monocytes cultured with electrical burn serum, and to explore the effect of VEGF on monocyte-endothelial cell adhesion. METHODS: The electrical burn serum of the rat was prepared. The normal serum from the rats without treating electric current was also collected for control. The contents of VEGF and its soluble receptor sFlt-1 in electrical burn group were determined by double-antibody sandwich ELISA. THP-1 cells were randomly divided into normal serum group and electrical burn serum group. The contents of VEGF and sFlt-1 in the culture supernatants were measured by double-antibody sandwich ELISA. THP-1 cells were also randomly divided into another 4 groups: normal serum group, electrical burn serum group, normal serum + inhibitor group and electrical burn serum + inhibitor group. THP-1 cells, which were incubated with the serum for 3 h and 6 h, were labeled with calcein-AM and then were added into the well with monolayer of endothelial cell line EA.hy926 to detect monocyte-endothelial cell adhesion. RESULTS: The levels of serum VEGF of the rats with electrical burns were significantly increased, the levels of serum sFlt-1 were significantly decreased as compared with the controls. The levels of VEGF secreted by THP-1 cells cultured with electrical burn serum were significantly increased, the levels of sFlt-1 were decreased correspondingly. Electrical burn serum enhanced monocyte- endothelial cell adhesion, sFlt-1 inhibited the adhesion between monocytes and endothelial cells. CONCLUSION: The monocytes exposed to the electrical burn serum secrete VEGF, which enhance the adhesion between monocytes and endothelial cells. Blockage of VEGF activity may effectively inhibit monocyte-endothelial cell adhesion.

Electrical burns; Monocytes; Endothelial cells; Adhesion

1000- 4718(2015)04- 0755- 04

2014- 11- 13

2014- 12- 15

武汉市卫计委临床医学科研项目(No. WX13A09); 武汉市科技局重点攻关项目(No. 20056007071)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.032

△通讯作者 Tel: 027-68894838; E-mail: wgxie@hotmail.com