硅球表面活性自由基印迹聚合物的制备与表征

林 冬，郭晶晶，李旭冉

（天津市环境监测中心，天津300191）

1 引言

随着科学进步和社会发展，食品安全早已成为全世界所面临的一个需要迫切解决的问题。但农产品中生物基质成分复杂干扰多，其前处理过程复杂，价格昂贵，耗时长，分析速度慢。本研究旨在发展新型样品前处理技术，以氯霉素这种毒性残留抗生素为目标测定物，采用在硅球上接枝iniferter－分子印迹技术适合从众多对象中快速筛选此目标，简化了样品处理过程。

分子印迹技术是高分子聚合物（MIP）对模板分子（也称印迹分子）具有特定性选择的技术。它通过模板分子、功能单体、交联剂之间的化学键作用，形成含有三维孔穴的聚合物。这个三维孔穴可以特异性地重新与印迹分子再结合，即对印迹分子具有专一性识别作用。表面分子印迹聚合法常选择具有良好的机械强度和耐用性的硅球作为载体，其优点一是模板分子可轻易地被完全洗脱下来提高了洗脱率和结合容量，二是聚合物的吸附位点均暴露在载体的表面，极大地降低了识别过程中的传质阻力，用其作为色谱固定相填料可以有效地改善峰形。

制备高分子聚合物大多数通过自由基聚合反应来完成，但传统的自由基聚合反应体系中，存在各种副反应使得聚合产物的分子量不均。为了解决这类问题，Otsu T等人提出了引发－转移－终止剂（initiatortransfer agent－terminator，iniferter），这是一种以光来引发、转移与终止自由基发生聚合反应的一类含N，N－二乙基二硫代氨基甲酰氧基团（R2S2C（S）N（C2H5）2）的一类化合物。

在紫外光的引发下，R－S－C（S）N（C2H5）2分解成具有活性的烷基R·和相对惰性的自由基·S－C（S）N（C2H5）2，前者能够引发单体进行聚合，后者则与增长的链自由基结合形成休眠种，从而在活性－休眠的可逆反应中控制了自由基链的增长的度，保证聚合产物的均匀。iniferter反应的引发机理可以用图1表示 。

图中，烷基R·自由基能够引发活性聚合，S·是惰性的休眠种，M为可聚合的单体，R－M·为由此产生的聚合物端基自由基，此自由基仍可以继续与单体M发生链增殖反应，形成新的活性自由基大分子，亦可与链终止自由基S·休眠种发生链终止反应。kp与kt分别代表增殖与终止反应速率常数。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

高效液相色谱仪；红外光谱仪；扫描电子显微镜；高压汞灯；压柱机。

2.2 试剂

氯霉素（Chloramphenicol，CAP，纯度98%）；四环素类（tetracycline，TCs）；硅球（粒径：10μm）；硅烷化试剂3－氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）；对氯甲基苯甲酰氯（纯度≥99.9%）；二乙基二硫代氨基甲酸钠；甲基丙烯酸（MAA）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）；碳酸钾，分析纯；无水甲苯，色谱纯；无水乙醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；实验用水；应符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682）一级水的相关要求。

3 实验步骤

3.1 硅球表面接枝Iniferter

取0.2g硅球与50mL无水甲苯于100mL三口瓶中，加入3mL硅烷化试剂APTES在80℃水浴加热下机械搅拌12h，此过程中始终保持氮气氛围，即制得接枝氨基的硅球。再加入2mmol对氯甲基苯甲酰氯，同时加入少许碳酸钾作为敷酸剂中和此步反应产生的HCl，在70℃水浴下搅拌反应8h，即制得接枝氯基的硅球。

将以上产物用少量无水甲苯清洗后烘干，加入20 mL无水乙醇机械搅拌。准确称取0.6g二乙基二硫代氨基甲酸钠溶解于12mL无水乙醇中，将其逐滴加入到搅拌体系中，搅拌过程无需加热，持续10h后用水、乙醇分别冲洗，40℃干燥，从而制得了iniferter接枝硅球。

3.2 Iniferter－印迹聚合物的制备

制备聚合物时，首先在玻璃瓶中加入15mL乙腈溶剂，取0.1mmol模板氯霉素和0.4mmol功能单体甲基丙烯酸溶解其中，静置预混合2h后取0.2g已接枝iniferter的硅球，分散到溶液中，再加入2mmol交联剂EDMA。然后将玻璃瓶密封，于高压汞灯下旋转照射4 h，以光来引发聚合反应。最后用乙腈洗净，再使用甲醇－醋酸（9∶1，v/v）溶液反复震荡，洗掉模板分子和未反应的单体，40℃干燥，即制得Iniferter活性自由基聚合硅球表面印迹聚合物（MIP）。按同样的方法在不加模板分子的条件下，制备非印迹聚合微球（NIP）。

4 结果与讨论

4.1 投料比例的选择

选用甲基丙烯酸作为功能单体。在分子进行印迹的过程中，模板分子和功能单体间的比例大小将直接影响印迹聚合物的识别能力。如果功能单体过少，会使形成的分子印迹聚合物的识别位点较少；过多则会形成大量的非特异性识别位点。对于交联剂来说，它的用量主要是影响分子印迹聚合物的机械稳定性和印迹识别孔穴的刚性结构。比较多的交联剂，会使形成的分子印迹聚合物交联度比较高，因此聚合物的刚性较大结构稳定；而刚性过大时，又会影响模板分子在聚合物孔穴内的传质以及模板分子与识别印迹位点之间的吸附、解吸平衡。本实验中，氯霉素的结合位点有三处，一般采用模板分子：功能单体：交联剂为1∶4∶20的比例，且以该比例制备的分子印迹聚合物的识别印迹性能最为良好。如果继续增加功能单体的比例，单体浓度的增大会导致非均一性吸附位点的形成，同时极其有可能促使副反应的发生。

4.2 溶剂用量的选择

单体在反应体系中的浓度也会影响聚合反应是否顺利进行。一般情况下，自由基类的反应聚合速度会随功能单体浓度的增加而加快。本实验试用了三种不同的溶剂用量，分别为10、15、20mL，以观察不同功能单体浓度对聚合反应状况的影响。经观察发现，在相同的反应时间（均为2h）内，当溶剂乙腈含量较少，聚合反应溶液呈粘稠凝胶状；而当乙腈含量较多时，生成的印迹聚合物质地良好。这是由于当功能单体浓度小，聚合反应会慢慢进行，相同反应时间内产生的印迹聚合物较少，不会暴增出大量聚合物，且单体与单体之间不会产生自聚反应；而当溶剂用量少导致功能单体浓度过大，聚合体系的整体粘度会随着聚合反应的进行不断加大，使得自由基链转移进行得越来越困难，活性自由基聚合反应的进行在一定程度上被抑制。综合反应速度和反应可控性两种因素，本实验选择溶剂的加入量为15mL。

4.3 电子扫描电镜表征

为了直观地了解接枝反应是否顺利进行，使用电子显微镜对硅球的外部形态进行表征。实验将各步反应产物洗脱干净后，40℃下干燥，用无水乙醇分散，通过电镜扫描可观察到反应前的硅球表面光滑无物、粒径均匀，随着iniferter接枝完成，硅球表面出现些许薄层，直至最后最终生成印迹聚合物，形态粗糙不平，但整体上印迹位点比较均匀地分布在表面。扫描电镜图如图2所示。

4.4 分子印迹与非印迹聚合物对氯霉素的保留与分离

硅球的机械稳定性和在有机溶剂中不溶胀的特点使其作为色谱填料成为可能。实验利用压柱法将印迹硅球（MIP）与非印迹硅球（NIP）分别装入不锈钢色谱柱。将150mm×4.6mm规格不锈钢柱一端封住，开口一端与压柱机下部出口连接并固定。取制得的干燥分子印迹聚合物2.0g于烧杯中，加入甲醇充分搅拌，注入压柱机上部入口，均匀装入柱中。

本实验选择在40MPa压力下压柱30min，压柱力度较小会使填料间留有缝隙，模板还来不及发生吸附便随流动相流出，而力度过大则使填料之间紧密失去流通孔隙，流动相无法通过，甚至会破坏硅球的机械结构致其破碎。此柱在流动相为4%乙酸－甲醇，流速为0.5 mL/min的情况下柱压为10.2MPa，在此流动相条件下考察了印迹与非印迹硅球对模板氯霉素及竞争物四环素类的分离。

进样体积20μL，检测波长278nm，印迹与非印迹硅球的色谱保留时间如图3所示，氯霉素出峰比四环素类要晚，说明印迹硅球含有与模板分子相匹配的印迹孔穴，该孔穴选择性地对氯霉素分子有更强的保留，使得模板分子的出峰时间较晚。在印迹色谱柱上，由于特异性吸附位点的存在，氯霉素的保留时间长于四环素类，两者能达到基线分离；而在非印迹色谱柱上，两者的保留时间差别不大，色谱峰不能完全分开。这表明，硅球表面接枝分子印迹聚合物具有印迹效果。

5 结论

本实验工作中，设计了一种以硅球为载体的光引发转移终止剂合成方法，即iniferter活性自由基聚合制备分子印迹聚合物并色谱分析中的应用分离氯霉素。这种方法一方面利用表面印迹将印迹聚合物吸附位点接枝固体载体表面，以此降低分子识别过程中的传质阻力；另一方面利用iniferter控制了聚合物的有序增长，克服了传统聚合物颗粒形状不规则、色谱性能差等缺点，有效地改善了峰形。高效液相色谱实验表明该填料印迹聚合物对氯霉素的识别性能明显优于非印迹聚合物。印迹聚合物的选择性富集作用，为减少农畜样品前处理步骤、测定样品中痕量残留抗生素分析打下了良好的基础。

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