微小RNA对骨重塑和炎症性骨吸收调控的研究进展

Progress research on regulation of microRNA on bone remodeling and inflammatory bone resorption

［文献标志码］A

［文章编号］1671－587Ⅹ（2015）01－0195－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150138

［收稿日期］2014－05－29

［基金项目］国家自然科学基金资助课题（81271111）

［作者简介］孙宏晨（1964－），男，黑龙江省哈尔滨市人，教授，医学博士，高分子化学与物理学博士后，主要从事颌骨重塑机制以及纳米材料与转基因治疗方面的研究。

［通信作者］孙宏晨，教授，博士研究生导师（Tel：0431－88796010，E－mail：hcsun＠mail.jlu.edu.cn）

人体骨骼系统终生都能通过骨形成和骨吸收过程不断进行重塑，并受多种因素影响。慢性炎症如牙周炎、风湿性关节炎等均可以通过干扰骨代谢导致骨质的吸收破坏 ［1］。目前普遍采用促进成骨细胞性骨形成、抑制破骨细胞性骨吸收的治疗策略维持机体的骨重塑平衡。miRNA是一类起源于内源性转录物、由18～22个核苷酸组成的单链非编码RNA，通过抑制靶mRNA的翻译或增强靶mRNA的降解来调控转录后水平基因表达 ［2］，在细胞增殖、分化、凋亡和代谢等生物学功能上具有重要的作用，并进一步参与细胞分化、组织发育、器官形成以及疾病发生 ［3－4］。研究 ［1］表明：miRNA不仅参与了炎症反应，而且通过多个信号通路对成骨细胞和破骨细胞等的增殖、定向分化和功能维持发挥调控作用。miRNA还通过调控炎性因子的表达进一步参与成骨细胞和破骨细胞介导的炎症性骨吸收。因此，以miRNA为靶点、不仅对阐明骨破坏性疾病的发生机制具有重要的理论意义，而且对治疗骨相关性疾病亦具有重要的临床意义。

1　miRNA的形成及作用机制

除Y染色体，人类其他染色体上均能发现转录为miRNA的基因序列。miRNA的启动子受表观遗传和转录因子的调控。机体内miRNA的合成需要经过多个步骤，包括转录、初级miRNA转录本（primary miRNA，pri－miRNA）的加工、运输至胞浆、miRNA前体（precursor miRNA，pre－miRNA）的加工、复制链的选择和靶定转录等，这种严格的多步合成过程有助于确保只有具备正确序列和结构的miRNA才能调控基因的表达 ［5］。

miRNA的基因来自于编码蛋白或非编码蛋白的内含子或独立编码miRNA的基因序列。在细胞核内，miRNA基因序列首先经RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ转录产生具有茎环结构的初级转录产物pri－miRNA ［6］。在哺乳动物中，primiRNA在RNaseⅢ核酸内切酶Drosha与DiGeorge综合征关键区基因8（Drosha－DiGeorge syndrome critical region gene　8，DGCR8）复合物作用下，加工成为60～100nt的发夹状pre－miRNA，继而在转运蛋白Exportin　5的协助下从核内运输至胞质中 ［7］。在细胞质中，另一种RNaseⅢ核酸内切酶Dicer与其搭档蛋白TRBP（Dicer－TAR RNA binding protein）所形成的复合物对pre－miRNA进行切割，产生结构类似于小干扰RNA的二聚体（双链miRNA） ［8］。RNA诱导的沉默复合体（RNA－induced silencing complex，RISC）由Dicer酶、TRBP、PKR的蛋白活化剂（protein activator of PKR，PACT）和Ago蛋白组成，双链miRNA 与RISC结合后被解旋酶分成两条链，其中一条是成熟的miRNA引导链，而另一条互补的随从链miRNA＊则立即降解 ［8］。见图1（插页四，图中红色标记部分为成熟的miRNA链）。

miRNA与RISC复合物发挥抑制靶mRNA作用的方式取决于miRNA和靶mRNA之间的配对程度。成熟miRNA 的5′端具有与靶mRNA的3′非翻译区（3′untranslated region，3′UTR）特异互补的“种子序列（seed region）”，这种靶向结合能引导靶mRNA的降解或抑制其翻译 ［9］。若miRNA与靶mRNA的碱基完全配对，则核酸内切酶Ago2降解靶mRNA，此过程可能发生在RNA加工小体中（processing bodies，P－body）；然而，若含有膨隆部分的miRNA和靶mRNA以不完全配对的形式结合则会引起翻译抑制，此为脱腺苷化作用的结果 ［10］。多数mRNAs的翻译起始是由于其5′帽端的m7G被真核翻译起始因子eIF4E识别所引起的。目前有研究 ［11］表明：RISC中的Ago蛋白成分其中心区域有着与eIF4E帽结合区同源的序列，能够与eIF4E竞争发挥翻译抑制的作用。

2　骨重塑和炎症性骨吸收

成骨细胞和破骨细胞是参与骨吸收和骨形成过程的重要细胞。有研究 ［12］显示：多能间充质干细胞通过Runx　2、成骨细胞特异性转录因子（osterix，OSX）和β－链蛋白（β－catenin）等转录因子的调控向成骨细胞分化。单核细胞／巨噬细胞系统通过巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）、RANKL、肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素（IL）等转录因子的调控向破骨细胞分化。当活化的成骨细胞在吸收陷窝中分泌新的骨基质时，能够通过骨保护素（osteoprotegerin，OPG）／核激活因子受体（receptor activation of NF－κB，RANK）／核激活因子受体配体（Ligand of receptor activation of NF－κB，RANKL）轴的作用，参与破骨细胞分化的负性调控过程，从而引起骨重塑的发生 ［13］。一旦破骨细胞达到高度活跃的程度或成骨细胞分泌的骨基质不足以填补吸收陷窝时就会干扰骨重塑的平衡，引起骨量减少或骨质疏松症 ［1］。

但是，骨重塑的平衡常被炎症因子打破，在炎症条件下，免疫系统产生的炎症因子如TNF、IL－1和IL－6等不仅能使炎症反应持续发生，还能显著增强破骨细胞的生成和功能，从而激活骨吸收途径，抑制骨重建。尽管破骨细胞的激活和分化主要依赖成骨细胞产生的M－CSF和RANKL，但TNF、IL－1和IL－6的存在能显著增强破骨细胞的生成和功能 ［14］。因此炎症反应间接参与了局部或系统性骨质流失的发生。

3　miRNA对骨重塑的直接调控作用

3.1　调控骨髓间充质干细胞（bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）向成骨细胞分化的miRNA BMMSCs是一类具有自我更新能力的多能干细胞，不仅可沿包括成骨细胞在内的多个谱系方向分化，还能够对多种环境因素作出应答 ［15］。胞外信号调节激酶（extracellular signal－regulated kinase2，ERK）通路在骨形成调控过程中发挥重要作用，包括对Runx2／Cbfa－1的磷酸化作用及诱导OSX基因表达等。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）信号通路与胞外基质蛋白激活的ERK1／2信号通路间具有密切联系。有研究 ［16］结果显示：破坏FAK信号通路会抑制OSX转录活性和hMSC成骨分化。证实了FAK是成骨细胞分化的力传导通路中的关键因素。①miRA－138。Eskildsen等 ［17］筛查了成骨细胞分化期间人类BMMSCs中表达有差异的miRNAs，并认定miR－138是成骨性分化过程的潜在抑制剂。通过PicTar软件预测并证实了miR－138潜在靶作用位点为编码FAK蛋白的蛋白酪氨酸激酶2（protein tyrosine kinase　2，PTK2）。FAK 和PTK2能够激活ERK1／2信号通路，从而使Runx2磷酸化及OSX上调使BMMSCs向成骨方向分化。利用antimiR －138抑制miR－138对FAK信号通路的活化过程，结果体内异位成骨增多且体外成骨分化明显增强；反之，miR－138过表达能抑制骨形成。表明miR－138能通过抑制FAK及其下游信号来抑制骨的形成过程。②miRNA－31。目前对于miRNA－31在BMMSCs向成骨细胞系分化过程中发挥的功能尚存争议。Gao等 ［18］采用微阵列芯片技术，发现miR－31在体外成骨分化过程中表达下调，并通过生物信息学分析证明Runx2是其作用靶点。在随后的相似研究中，Baglìo等 ［19］通过基因芯片技术分析了BMMSCs成骨分化时的miRNA表达谱，发现miR－31表达上调并证实其靶定目标之一是骨特异性转录因子OSX。另一个体外研究组还提出了在miR－31、Runx2和Satb2（special AT－rich sequence－binding protein　2）间还存在反馈调节通路：在BMMSCs分化过程中Runx2介导了miR－31的表达下调，从而增加了Satb2蛋白水平并促进BMMSCs其向成骨细胞系的分化 ［20］。

3.2　调控成骨细胞功能的miRNA Dicer酶是miRNA成熟所必须的酶。为了探究miRNA对骨重塑的调控作用，普遍利用基因敲除技术使小鼠体内的Dicer酶功能缺失，再依据其表现型间接分析miRNA与成骨或破骨间的关系。Gaur等 ［21］采用Cre－loxP系统的条件性敲除技术，通过成骨细胞特异性标志物鼠Ⅰ型胶原（COL1A1）基因和骨钙蛋白（osteocalcin，OC）基因的启动子来驱动Cre重组酶的表达，使其特异性识别LoxP重组序列从而去除靶基因片段。利用COL1A1启动子敲除骨祖细胞中的Dicer基因，会引起小鼠胚胎晚期死亡。而靶定敲除成熟成骨细胞中表达OC启动子的Dicer基因，可导致小鼠表现出围产期的骨钙化延迟现象。因此，可以说明经Dicer加工的miRNA的产物对于孕期骨骼发育以及产后骨的生长非常关键。①miR－2861。miR－2861是一种在小鼠原代成骨细胞中高表达的miRNA基因。当小鼠骨髓基质细胞中的miR－2861基因被沉默，就会导致BMP－2诱导的成骨细胞分化能力下降，而miR －2861的过表达则会促进成骨细胞分化。BMP信号能刺激Runx2乙酰化并抑制Smurf介导的Runx2降解，而组蛋白去乙酰化酶5（histone deacetylase　5，HDAC5）则干扰该过程使成骨分化受抑制。荧光素酶报告证实HDAC5是miR －2861的靶基因，所以抑制HDAC5的miR－2861可使乙酰化的Runx2大量增加继而促进成骨细胞分化。此外，有临床研究 ［22］表明：人类体内的Pre－miR－2816突变会导致原发性骨质疏松症。近期又有研究 ［23］证实：与miR－2861处于同一基因座位点的miR－3960也具有类似的调控作用，并建立了一个Runx2／miR－3960／miR－2861正反馈调控系统，促进成骨细胞的分化。这些研究都说明miRNA在骨代谢紊乱性疾病中发挥的作用。②miRNA－15b。最新研究 ［24］发现：miR－15b对成骨细胞分化具有正向调控作用。在BMP蛋白与其受体结合后，SMAD蛋白家族磷酸化从而激活Runx2和其他成骨标志性基因。Smurf1作为SMAD特异的泛素蛋白连接酶，可与转录因子Runx2相互作用并通过蛋白酶途径使其降解。用miR－15b抑制剂处理成骨分化时期的hBMSCs，结果Runx2的蛋白水平下降；反之，miR－15b的过表达会显著增加Runx2水平，降低Smurf蛋白水平。经荧光素酶报告证实，miR－15b可直接靶定Smurf的3′UTR使Smurf蛋白降解。因此，miR－15b能抑制Smurf1的降解作用从而间接保护Runx2蛋白来促进成骨细胞分化。

3.3　调控破骨细胞功能的miRNA　目前关于miRNA在破骨细胞中作用的研究相对有限，但也可通过特异敲除破骨细胞不同时期的Dicer基因来确定miRNA的功能。敲除骨祖细胞中的Dicer会使小鼠因破骨细胞数目及骨吸收减少而表现出轻微的骨硬化现象，但对成骨细胞却无影响 ［25］。敲除成熟破骨细胞的Dicer，结果破骨细胞数量减少导致骨小梁处的骨沉积增多。由于破骨细胞的分化是经RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）介导的，所以在敲除Dicer基因时，M－CSF受体表达的下降与破骨细胞数量减少有密切联系 ［26］。可见，依赖Dicer酶成熟的miRNAs对于骨吸收的调控是必不可少的。①miR－124。在RANKL激活破骨细胞分化的过程中，活化T细胞核因子蛋白1 （NFATc1）作为主要的转录因子发挥了重要作用。研究 ［27］表明：miR－124通过抑制NFATc1的表达调控了小鼠骨髓巨噬细胞分化为破骨细胞的过程。通过特异性抑制miR－124结果增强了破骨细胞的分化和NFATc1的表达。同时，miR－124也影响了破骨细胞前体细胞的增殖及运动。这些研究结果不仅揭示了miR－124在破骨细胞形成中的重要作用，还阐述了NFATc1在破骨细胞形成中新的调控方式。②miR－223。Sugatani等 ［28］发现：在RAW264.7中，pre －miR－223前体的高表达能完全阻止抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色阳性的多核细胞形成，而敲除miR－223基因会使经RANKL诱导的破骨细胞样细胞减少。在随后的研究 ［25］中又发现：通过影响NFI－A和MCSF受体的表达，可实现miR－223对破骨细胞形成的调控。这些研究结果表明：适当的miR－223表达水平对破骨细胞的正常分化和形成具有重要作用。

4　炎症条件下miRNA对骨重塑的间接调控作用

Toll样受体（Toll－like receptors，TLR）是一类表达于固有免疫细胞上的识别分子，能通过与病原体相关分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）的特异结合活化细胞内信号通路激酶，促进炎症因子的表达并产生免疫应答和炎症反应。目前有研究 ［29］证明：miRNA可识别TLR并对TLR信号通路中的细胞因子具有负性调控作用。

4.1　miRNA－155　Ceppi等 ［30］发现：包括miR－155在内的多种miRNAs参与了细菌脂多糖（LPS）对树突细胞（dendritic cells，DCs）刺激后产生的免疫应答。利用锁核酸沉默技术（LNA silencing，lock nucleic acid silencing）与基因芯片相结合的方法，证实了TLR／IL－1炎症信号通路是miRNA－155的作用靶点，且miR－155能直接调控TAK1结合蛋白2（TAK1 binging protein　2，TAB2）的水平。TAB2作为TLR通路级联反应的信号转导分子能够促进依赖IL－1的TRAF6泛素化并激活p38和NFκB。在DCs成熟早期，miR－155低表达能活化p38MAPK通路从而促进IL－1β的表达，而miR－155又直接受控于IL－1β及其信号通路级联反应；在DCs成熟晚期，miR－155高表达会抑制p38 MAPK通路，沉默IL－1和细胞细胞因子的表达 ［30］。因此在成熟DCs中，miR－155通过负反馈通路下调由微生物刺激所产生的炎症因子。

骨形态蛋白（BMPs）能诱导异位骨形成，并受炎症因子（如TNF）的负性调控作用。TNF－α通过NF－κB通路抑制BMP信号或通过激活应激活化蛋白激酶（SAPK）／氨基末端激酶（JNK）信号通路抑制由BMP诱导的成骨细胞活性 ［1］。有研究 ［31］表明：在BMP－2所诱导的成骨分化过程中，沉默miR－155基因能减轻由TNF－α介导的成骨抑制作用；经生物信息学分析证实miR－155的靶点是细胞信号抑制因子（suppressor of cytokine signaling　1，SOCS1）的3′UTR，且TNF－α可通过JNK信号通路诱导miR－155的表达，表明TNF－α通过作用miR－155调控成骨分化的。

4.2　miR－29　巨噬细胞和NK细胞分泌的干扰素γ （interferonγ，IFN－γ）可抑制IL－1和TNF－α对破骨细胞活性的诱导，从而调控破骨细胞的分化。用细菌感染小鼠会使NK细胞中miR－29表达下调，而荧光素酶报告显示miR－29可直接结合IFN－γ的3′UTR来抑制mRNA翻译。因此，miR－29能通过靶定IFN－γ抑制胞内病原体所引起的炎症反应 ［32］。尽管目前尚无研究直接验证miR－29在炎症条件下与骨重塑的必然联系，但已有研究 ［33］结果表明：miR－29的表达能通过正反馈途径来调控经典Wnt信号通路，从而促进成骨细胞分化。由此可推断，miR－29或许在一定程度上是通过调控炎症因子来影响成骨细胞分化的。

5　展　望

作为转录后调控因子，miRNA虽然在所有RNA中的比重很小，却参与了人类体内约三分之一基因表达和转录的调控过程。近年来，miRNAs在基因表达调控领域里的研究已有了突破性进展，很多组织特异性的miRNAs其功能在骨和关节组织中已经被证实。尽管如此，识别miRNAs其潜在的靶点仍是需要深入研究，还有大量对骨具有重要作用的miRNAs有待发现，并需进一步明确其在骨形成、骨重塑、骨损伤修复及炎症相关性骨疾病中发挥的作用。随着对miRNA调控机制的不断深入了解，应用miRNA治疗炎症性骨吸收和骨代谢紊乱疾病将会在不远的将来成为现实。