结缔组织生长因子盖髓剂对牙髓组织形态学的影响及其意义

［文献标志码］A

［文章编号］1671－587Ⅹ（2015）01－0110－04

DOI：10.13481／j.1671－587x.20150121

［收稿日期］2014－08－12

［基金项目］吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题（20130102096JC）；吉林省长春市科技局科技计划项目资助课题（12SF88）

［作者简介］李　雯（1989－），女，山西省长治市人，在读医学硕士，主要从事牙髓生物学方面的研究。

［通信作者］张颖丽，教授，硕士研究生导师（Tel：0431－88796017，E－mail：zhangyingli1989＠163.com）

Influence of capping agent CCN2in morphology of dental pulp tissue

LI Wen 1，YIN Shuo 2，ZHANG Juan 1，WANG He 1，GAN Kang 3，MA Shanshan 4，ZHANG Yingli　 1

（1.Department of Operative Dentistry and Endodontics，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；2.Department of Prosthodontics，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；3.Department of Comprehensive Treatment，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China；4.Department of Implantation，Stomatology Hospital，Jilin University，Changchun　130021，China）

Abstract：Objective To observe the histomorphological changes of dental pulp of the rats with mechanical injury at different time points after treated with connective tissue growth factor（CTGF／CCN2）and to clarify its mechanism.Methods Tweenty Wistar rats were divided into five groups，one group was randomly selected as normal group，each Wistar rat in the other four groups（groups of　3d，7d，14dand　28d）was prepared with a cavity on the occlusal surface of maxillary first molars on both sides.CCN2was applied on the left exposed pulp for the PBS experimental group，and PBS was applied on the right exposed pulp for the control group.Four rats，one in each group，were put to death respectively on the　3rd，7th，14th and　28th day after operation.The teeth of each rat were fixed，decalcified and made to sections，which were stained with HE.The histomorphological changes of dental pulp tissue in each sample were observed.Results In control group，the inflammation under the amputated site was more obvious than the experimental group at　3dand　7d；the inflammatory cells were decreased andscattered reparative dentin was observed in　14d；necrosis was observed at　28d.While in experimental group a large number of inflammatory cells gathered under the amputated site at　3d，as well as the dilatation of blood vessels was observed；7dafter injury the inflammation in experimental group was reduced.Compared with control group，the leukomonocytes were less.After injury for　14dthe calcified bridge was observed and the inflammatory cells disappeared；28 d after injury the reparative dentin was observed.Conclusion CCN2 participates in the reconstruction of the tissue structure after dental pulp injury.It indicates that CCN2is a good pulp capping agent.Keywords：connective growth factor；dental pulp；dental pulp capping；reconstruction

牙髓组织是疏松的结缔组织，是牙体组织中唯一的软组织，具有形成牙本质、营养、感觉和防御功能及修复再生能力 ［1］。当遇到感染和组织损伤等外源性刺激时，牙髓可产生由各种细胞因子介导一系列级联反应。牙髓损伤后的修复是一个很复杂的过程，通常认为成纤维细胞、中性粒细胞和牙髓干细胞的迁移、血管再生以及修复性牙本质的形成是牙髓组织在修复过程中的基本特征 ［2］。活髓治疗一直被认为是牙髓生物学中最可靠的治疗方法。如何促进牙髓组织结构的重建和形成牙体硬组织是目前研究的焦点。最近研究 ［3－5］显示：CCN蛋白由一组具有高度序列同源性的多肽因子组成，在胚胎发育、炎症反应、损伤修复、纤维性疾病和肿瘤的发生中起重要作用。而结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF／CCN2）是CCN家族的重要成员，早期国内学者发现CCN2在肿瘤细胞中过度表达时肿瘤细胞转移浸润的能力更强。Muromachi等 ［6］体外研究证实：CCN2在基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinases－3，MMP－3）的诱导下可以促进牙髓细胞的增殖、迁移和血管的再生。随后又有学者 ［7］发现：CCN2可以促进软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞增殖、迁移及血管形成。本研究将CCN2用于大鼠牙髓损伤创面，观察牙髓损伤修复过程中组织的形态学变化，为临床开发新的盖髓剂提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　实验动物、主要试剂和仪器　清洁级8周龄雄性Wistar大鼠20只，体质量180～220g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（吉）2013－0001。3%水合氯醛、乙醚均购自长春市永辉化工商贸有限公司；胶原蛋白海绵，由吉林大学口腔颌面外科提供；100g·L －1EDTA溶液、4%多聚甲醛和3%生理盐水均购自北京恒业中远化工有限公司；CCN2购自美国Sigma公司。1／4钨钢球钻和高速涡轮机购自上海医用仪器设备厂；双目光学显微镜（BD－45B2）购自德国UBM生物技术公司；开口器为自制。

1.2　动物标本的制备　将20只Wistar大鼠称体质量，适应性饲养1周后，平均分为5组，随机取一组为正常组，其余4组分别为3、7、14和28d组。除正常组外，每组大鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢成仰卧位。2%碘伏溶液消毒口腔，双侧上颌第一磨牙用1／4球钻在颌面中央制洞，见穿髓孔时停止操作，生理盐水冲洗。无菌棉球干燥牙面，在左侧上颌第一磨牙露髓处放含有CCN2（100g·L －1）的胶原蛋白海绵作为实验组，在右侧上颌第一磨牙露髓处放含有PBS缓冲液的胶原蛋白海绵作为对照组，用富士Ⅸ玻璃离子充填窝洞。各组大鼠分别于3、7、14和28d心脏灌流处死，待组织变硬立即断头取上颌牙齿标本，并置于4%多聚甲醛中常温固定48 h后，再置于100g·L －1　EDTA溶液中脱钙10周，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋。将标本连续切片，片厚5μm。

1.3　HE染色方法　将切片放入60℃的烘片机中过夜将蜡烤化，次日取出依次放入脱蜡二甲苯（Ⅰ）中10min，脱蜡二甲苯（Ⅱ）中10min，再放入无水酒精（Ⅰ）中5 min，无水酒精（Ⅱ）中5 min，90%、85%和80%酒精各1～3min，然后流水冲洗5min左右，观察切片直至清亮，不成云雾状即可。冲洗后放入苏木精中染色6min左右，再移入流水冲洗，去掉大部分浮色后再放入1%盐酸酒精分化数秒，流水冲洗。氨水（pH＝8.0）浸泡约数秒，流水冲洗。再放入0.5%伊红溶液中浸染5min。然后依次80%、85%、90%和95%酒精各1～2min，然后分别放入无水酒精（Ⅰ）和无水酒精（Ⅱ）5min，最后二甲苯透明5～10min，用中性树胶封片。

1.4　大鼠牙髓组织形态学观察　光镜下观察对照组和实验组大鼠上颌第一磨牙的炎症反应情况和修复性牙本质形成情况。

2　结果

2.1　正常组大鼠牙髓形态学　光镜下观察，正常组大鼠牙髓组织分为成牙本质细胞层、乏细胞层、多细胞层和固有层。外层成牙本质细胞呈栅栏状排列紧密、整齐，内侧成纤维细胞呈星形，间质可见少量血管和纤维组织。见图1（插页三）。

2.2　对照组大鼠牙髓形态学　光镜下观察，对照组中3d组大鼠在露髓点下方可见大量炎细胞浸润，炎症较实验组明显，血管扩张，前期牙本质无明显变化（图2A，见插页三）；7d组炎症细胞向正常牙髓内浸润，数量较相对应的实验组多，成纤维细胞与牙本质之间有少量的前期牙本质形成，无骨样牙本质及修复性牙本质生成（图2B，见插页三）；14d组仍存在一定范围的炎细胞浸润，但前期牙本质不均匀增厚，可见散在修复性牙本质（图2C，见插页三）；28d组可见髓室内牙髓有变性坏死征兆，但仍可见增厚的前期牙本质形成了一定量的修复性牙本质（图2D，见插页三）。

2.3　实验组大鼠牙髓形态学　光镜下观察，实验组中3d组大鼠在露髓点下方可见大量炎细胞聚集，成牙本质细胞排列紧密，可见明显的血管扩张及新生血管（图3A，见插页三）；7d组炎症减轻，大量的成牙本质细胞样细胞聚集，可见成纤维细胞与牙本质之间形成少量前期牙本质（图3B，见插页三）；14d组形成连续完整的钙化桥，成牙本质细胞样细胞增生活跃，排列紊乱，无明显炎细胞浸润（图3C，见插页三）；28d组在髓室内已形成非常厚的修复性牙本质，成牙本质细胞排列正常，牙髓组织内无明显炎细胞浸润（图3D，见插页三）。

3　讨论

牙本质构成牙体硬组织的主体，而牙髓组织则包含于中央的髓腔中，主要由牙髓成纤维细胞、成牙本质细胞、未分化间充质细胞和防御细胞组成 ［8］。成牙本质细胞排列在髓腔最外层，当牙髓组织受到外界轻微刺激时，成牙本质细胞分泌基质形成前期牙本质，并与牙髓形成牙髓－牙本质复合体保护牙髓不受损伤。当牙髓受到较强烈的刺激如感染或外伤导致暴露时，其储备的未分化间充质干细胞迁移至损伤处增殖，分化为成牙本质细胞样细胞，分泌牙本质基质，最终形成修复性牙本质，这是牙髓自身修复的潜能，也是活髓保存治疗的生物学基础 ［9］。从传统的氢氧化钙盖髓剂到现在新兴的三氧化矿物凝聚体（MTA） ［10］盖髓剂对牙髓损伤后组织的改建起到了一定的作用。但是氢氧化钙中高钙离子浓度常常使牙髓组织凝固性坏死，而MTA价格昂贵，不宜用于基础研究。许多学者研究 ［11－13］发现：CCN家族的成员之一CCN2一直是近几年来研究的热点，其广泛存在于人类各结缔组织，主要由成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、神经细胞和癌细胞等分泌合成。在胚胎发育与分化，血管形成与再生，伤口修复，纤维性病变，炎性病变，肿瘤的发生发展，骨的形成与修复等多种生物学过程中起重要的作用。早期研究 ［14－15］显示：CCN2主要在软骨细胞、成骨细胞和血管内皮细胞中可检测到，可促进软骨细胞的分化和细胞外基质的形成。所以本研究中拟设定CCN2对牙髓组织损伤后的改建会有一定的促进作用，并将CCN2用作盖髓剂，观察牙髓组织在修复过程中的形态学变化。

本研究结果显示：实验组中3d组和对照组大鼠牙髓均出现明显的炎症反应，细胞胞体固缩、扁平，血管扩张。这就在一定程度上说明了早期阶段的炎症反应是牙髓修复过程中关键的一部分 ［16］。随着免疫防御系统的免疫应答作用增强，本研究中实验组7d时炎症逐渐减轻，炎细胞以淋巴细胞为主。成牙本质细胞在髓腔内细胞因子的刺激下分泌活动加剧，在损伤的早期阶段分泌细胞外基质形成病理性沉积，即前期牙本质。由于受到强烈的外伤刺激，原代成牙本质细胞合成分泌基质的同时很快凋亡，此时牙髓组织内具有分化潜能的牙髓间充质干细胞将移行到该处，并分化为成牙本质细胞样细胞取代死亡的细胞 ［17］，然后继续合成分泌基质形成骨样牙本质；14d时中前期牙本质逐渐增厚形成有管状结构的连续的钙化桥，而对照组由于缺少盖髓剂仍存在一定范围内的炎症；28d时穿髓孔的下方的成牙本质细胞样细胞分化越来越完善，最终获得细胞突。这就使得其分泌的胶原在骨样牙本质周围逐渐沉积形成具有管状结构的修复性牙本质。本研究结果同时显示：对照组28d时可以看到露髓处下方有明显的坏死病灶，但由于牙髓－牙本质复合体对外界刺激的防御性反应，仍形成了一定范围的反应性牙本质。

综上所述，牙髓损伤后组织的改建过程是一个很复杂的生物学过程，可以概括为以下几个方面 ［18］：初期阶段必不可少的炎症反应如炎细胞大量聚集，血管扩张以及新生血管的形成等；成牙本质细胞分泌活动的增强和凋亡；牙髓间充质干细胞在损伤部位增殖并分化为成牙本质细胞样细胞；成牙本质细胞样细胞向外分泌基质形成修复性牙本质。同时本研究结果表明：CCN2盖髓剂对牙髓损伤后组织的改建有一定的促进作用，是一种良好的盖髓剂，但其作用机制需要进一步研究。