人体内复方甘草酸苷胶囊药代动力学和生物等效性研究

张 惠，阳国平

(中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013)

人体内复方甘草酸苷胶囊药代动力学和生物等效性研究

张 惠，阳国平

(中南大学湘雅三医院，湖南 长沙 410013)

目的研究复方甘草酸苷胶囊在健康男性体内的药代动力学和生物等效性。方法用自身前后对照方法，24例健康男性受试者按随机号分为受试组和参比组，交替服用75 mg复方甘草酸苷胶囊和复方甘草酸苷片两种制剂，72 h内间断采血；采用液-质联用法测定甘草酸苷代谢物甘草次酸的血药浓度,计算药代动力学参数,判定两制剂是否人体生物等效。结果复方甘草酸苷胶囊和片剂在人体内药时曲线符合二室模型，主要药代动力学参数AUC0～t分别为(4 284±1 149)ng·h/ml和(4 513±1 639)ng·h/ml，AUC0～∞分别为(4 369±1 179)ng·h/ml和(4 691±1 839)ng·h/ml，Cmax分别为(290.0±69.6)ng/ml和(293.4±80.9)ng/ml，Tmax分别为(12.08±1.38)h和(11.92±2.32)h；两种制剂的主要药代动力学参数Cmax，AUC0～t经对数转换后进行方差分析及双单侧t检验，并计算90%置信区间，表明两种制剂人体生物等效，受试制剂复方甘草酸苷胶囊的人体相对生物利用度为(112.7±51.6)%。结论两制剂具有生物等效。

甘草酸苷；生物等效性；液-质联用

复方甘草酸苷胶囊和复方甘草酸苷片都为甘草酸苷、甘氨酸、蛋氨酸各25 mg组成的复方制剂，其中甘草酸苷具有抗炎、保护肝功能等药理作用。临床上主要用于慢性肝病和肝功能异常及湿疹等疾病的治疗[1-2]。同时甘氨酸和蛋氨酸具有解毒和抗变态反应作用。主要发挥药理作用的是甘草酸苷或其胺盐在体内的代谢物甘草次酸，所以根据人体血液中甘草酸苷的药动学规律可以评价其制剂的生物利用度。由于人血浆中的甘草酸苷代谢物浓度较低，且体内代谢物复杂，一般分析方法如HPLC-UV[3-4]，很难满足检测要求。本研究建立了液-质联用法测定人血浆中甘草次酸的方法，该方法不仅灵敏度和精密度好，而且方便快捷。能有效地考察复方甘草酸苷胶囊的药代动力学，作出人体生物等效性评价。

1 材料与方法

1.1 受试者入选标准 生物等效性试验一般需要做18～24例，我们选择做24例试验。24名男性健康受试者，体重指数19.2～24.0 kg/m2，包括边界值，年龄19～26岁。所有受试者均通过健康体格检查,实验室检查(心电图、肝肾功能、血常规等)均属正常，精神状态良好。在试验期1个月内不得抽烟喝酒，且在试验期1个月内不得服用任何其他药物。所有受试者认真阅读知情同意书，无异议后自愿签署，并经本药物临床试验机构伦理委员会审批同意。

1.2 药品及试剂 受试制剂(T)：复方甘草酸苷胶囊(批号：071101；海南绿岛制药有限公司)；参比制剂(R)：复方甘草酸苷片(批号：09047；日本米诺发源制药株式会社)；甘草次酸标准品从中国食品药品检定研究院购买，含量为99.8%，批号：110723-200612；熊果酸标准品从中国食品药品检定研究院购买，含量为100%，批号：110742-200517；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司生产)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司生产)；乙酸乙酯(分析纯，西陇化工股份有限公司生产)等。

1.3 给药方案 24例受试者随机分成参比组和受试组俩组，每组12例，按2×2交叉方案设计，两期研究间的清洗期为14 d。参比组先服用复方甘草酸苷片，受试组服用复方甘草酸苷胶囊，药物清除期前后服用不同的制剂。在服药前禁食12 h，第二天早晨空腹口服3粒参比制剂(R)或受试制剂(T)，统一饮水250 ml，服药后2 h内禁水、禁食，至给药后4 h给予统一低脂标准餐。

1.4 血浆样品采集 分别于给药前(0 h)及给药后2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、10.0 h、12.0 h、14.0 h、18.0 h、24.0 h、36.0 h、48.0 h、60.0 h、72.0 h各取静脉血4 ml，3 000 r/min离心10 min，分离出血浆约2.5 ml，立即分装置EP管中于-20℃低温保存待测。

1.5 血浆样品测定

1.5.1 色谱条件 Agilent 1200型系列高效液相色谱仪，Agilent 6110质谱仪；色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，4.6×150 mm；流动相采用梯度洗脱；柱温、流速及流动相梯度变化值见表1。在此色谱条件下，甘草次酸的出峰时间约为4.8 min，内标物熊果酸的出峰时间约为8.8 min，两个峰之间分离良好，血浆中无内源性物质干扰分离，见图1。

表1 柱温、流速及流动相梯度变化值

图1 总离子流图

1.5.2 质谱条件 电喷雾电离源(ESI)，碰撞诱导解离150，干燥气体流速10 L/min，干燥气为氮气，温度300℃，压力为40 psig，毛细管电压3 000 V，选择性负离子监测(SIM)，质荷比(m/z)为469.4(甘草次酸)，455.4(熊果酸)带负电荷的分子离子峰，见图2。

1.5.3 血浆样品预处理 提前将氮吹仪的水浴温度设置为45℃，并从超低温冰箱取出甘草酸苷冰冻血浆样品，置于室温下融化，离心约30 s。取10 ml离心管，加入0.5 ml血浆并加入内标液(6.39 μg/ml) 30 μl，漩涡混匀，加乙酸乙酯5 ml涡旋混合2 min， 3 500 r/min离心10 min。定量吸取乙酸乙酯层4 ml置离心管中，放入45℃水浴锅中，氮气流吹干，取出离心管放凉后，加入100µl甲醇溶解，精密吸取上清液5µl进行液-质分析，按内标法以峰面积定量。

图2 质谱图

1.5.4 标准曲线制备 精密称取甘草次酸对照品9.9 mg置于100 ml容量瓶中，加适量甲醇振摇溶解，再加入甲醇定容，制得99µg/ml标准储备液；精密称取内标物熊果酸9.4 mg置于100 ml容量瓶中，加适量甲醇振摇溶解，再加入甲醇定容，制得94 g/ml储备液，逐步用甲醇稀释得6.39 g/ml的内标液。取健康人空白血浆10 ml若干份，分别加入甘草次酸标准储备液配制浓度分别为1.96 ng/ml、4.9 ng/ml、19.8 ng/ml、79.2 ng/ml、158.4 ng/ml、316.8 ng/ml和633.6 ng/ml的标准含药血浆。按“1.5.3”项下操作，同时制备空白样品，进行液-质分析，计算甘草次酸峰面积As和内标峰面积Ai的比值F。以比值F(F=As/Ai)对血药浓度C作回归计算，得回归方程F=0.001 8C+0.002 4，权重系数w=1/C2，r= 0.999 5，甘草次酸浓度在1.96～633.6 ng/ml与峰面积比线性良好，最小可定量浓度为1.96 ng/ml。

1.5.5 检测方法验证 取甘草次酸储备液，用甲醇逐步稀释配制得4.9 ng/ml、79.2 ng/ml、316.8 ng/ml的3种浓度的标准血浆样品，按“1.5.3”项处理后进行液-质分析，同时配制相应浓度对照品甲醇溶液，进行液-质分析，分别记录两种样品的色谱峰面积，将两者进行比较计算萃取回收率。另取甘草次酸储备液，用甲醇逐步稀释配制得4.9 ng/ml、79.2 ng/ml、316.8 ng/ml三种浓度的标准血浆样品，按以上样品处理方法进行处理后，取样进行检测分析，代入标准曲线计算出浓度，将所得的浓度与已知加入浓度相比，计算相对回收率，计算日内和日间精密度，见表2。

表2 甘草次酸回收率及精密度测定结果(n=5，±s)

表2 甘草次酸回收率及精密度测定结果(n=5，±s)

4.9 79.2 316.8 85.6±3.2 88.1±1.8 89.5±0.5 96.4±1.6 97.8±2.0 97.5±1.4 4.0 3.9 1.0 6.5 3.6 1.3

1.6 试验数据统计分析 采用DAS2.1版软件计算药代动力学参数，参数用SPSS11.5进行统计分析。以末端相血药浓度的对数值对时间进行回归，求得斜率Ke及T1/2，运用梯形法计算曲线下面积AUC0～t，AUC0～∞=AUC0～t+ct/Ke；以实测值计算Cmax和Tmax。AUC0～t和Cmax经对数转换后进行方差分析，在a=0.05水平进行双单侧t检验，按受试制剂Cmax在参比制剂75%～133%，AUC0～t在80%～125%内判定标准，考察两制剂是否具有人体生物等效性。

2 试验结果

2.1 药代动力学参数 24例志愿者交替口服复方甘草酸苷胶囊与片剂75 mg平均药时曲线见图3，主要药代动力学参数见表3。

图3 24例志愿者口服两种复方甘草酸苷制剂后的甘草次酸平均血药浓度-时间曲线

表3 24例志愿者口服两种复方甘草酸苷制剂后的药代动力学参数(n=5，±s)

表3 24例志愿者口服两种复方甘草酸苷制剂后的药代动力学参数(n=5，±s)

参数AUC0～t(ng·h/ml) AUC0～∞(ng·h/ml) T1/2(vh) Tmax(h) Cmax(ng/ml)参比制剂4284±1149 4369±1179 8.242±3.402 12.08±1.38 290.0±69.6受试制剂4513±1639 4691±1839 7.840±4.137 11.92±2.32 293.4±80.9

2.2 人体生物等效性 两种制剂间和给药次序间差异无统计学意义，Cmax在不同给药周期间无显著差异，双单侧t检验的统计参数th和tl两药均大于单侧t(0.05，18)(1.75)，AUC0T、AUC0～∞在不同给药周期间差异有统计学意义，方差分析表明：两种制剂的AUC0T、AUC0～∞、Cmax在剂型间、个体间和周期间差异无统计学意义。复方甘草酸苷片和复方甘草酸苷胶囊中甘草次酸的Tmax值经Wilcoxon检验，不同制剂间差异无统计学意义(Z=-0.587，P=0.557)。按照生物等效性的标准判定两种不同制剂生物等效，分析结果见表4。

表4 人体生物等效性分析结果

2.3 受试者临床观察结果 受试者空腹口服75 mg甘草酸苷后，所有受试者身体无明显不良反应发生。

3 讨论

该研究采用液-质联用法测定人血浆样品中甘草酸苷的代谢物甘草次酸的浓度，文献报道的流动相组分为甲醇、冰醋酸水溶液[5-7]，由于我们选择负离子为检测离子，所以流动相组分选择为乙腈和醋酸铵溶液，醋酸铵有效地提高了甘草次酸的离子化，使其质谱响应值显著增大；同时我们以单一溶剂乙酸乙酯萃取血浆样品，操作简单快捷，较文献报道的使用混合溶剂乙醚-二氯甲烷或乙醚-乙酸乙酯萃取回收率高；并较固相萃取法[8]操作简单，且很大地节约了试验成本。本法不仅样品预处理操作简便，而且灵敏度和精密度好，适于甘草酸苷药代动力学及人体生物等效性研究。

24名受试者口服复方甘草酸苷胶囊与复方甘草酸苷片后，主要药代动力学参数经统计学检验差异无统计学意义(P＜0.05)，说明两种制剂在人体内的动力学过程基本相似。经计算受试制剂的平均相对生物利用度为(112.7±51.6)%；经人体生物等效性统计分析，均表明两种不同厂家生产的复方甘草酸苷制剂具有人体生物等效性。

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Study on bioequivalence and pharmacokinetics of compound glycyrrhizin capsules in healthy volunteers.

ZHANG Hui,YANG Guo-ping.The Third Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410013,Hunan, CHINA

Objective To study the bioequivalence and pharmacokinetics of compound glycyrrhizin capsules in human plasma.Methods75 mg compound glycyrrhizin preparations were given to 24 healthy male volunteers in randomized two-way crossover design for the pharmacokinetic and relative bioavailability study.The volunteers were equally and randomly divided into test preparation group and reference preparation group,which were given compound glycyrrhizin capsules followed by compound glycyrrhizin tablets,compound glycyrrhizin tablets followed by compound glycyrrhizin capsules,respectively,with an interval of 14 d.The blood samples were collected within 72 h after taking medicine.Plasma concentration of glycyrrhetic acid were determined by high performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS).ResultsThe concentration-time curves of compound glycyrrhizin capsules and compound glycyrrhizin tabletsin vivowere in accordance with two compartment model.The main pharmacokinetic parameters of the two preparations were:AUC0～t(4 284±1 149)ng·h/ml and(4 513±1 639)ng·h/ml,AUC0～∞(4 369±1 179)ng·h/ml and(4 691±1 839)ng·h/ml,respectively,Cmax(290.0±69.6)ng/ml and(293.4±80.9)ng/ml,Tmax(12.08±1.38)h and(11.92±2.32)h.The mean relative bioavailability of test preparation to reference preparation were (112.7±51.6)%.ConclusionThe reference preparation and the test preparation are bioequivalent.

Glycyrrhetic acid;Bioequivalence;High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)

R969.1

A

1003—6350（2015）19—2931—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1067

2015-01-05)

阳国平。E-mail：ygp9880@163.com