直接RT-LAMP检测EV71方法的建立和评价

阮美生，郭龙华，周天龙，黎 荣

(1.湖北科技学院附属第二医院检验科，湖北 咸宁 437100；2.深圳市龙华新区人民医院检验科，广东 深圳 518109）

直接RT-LAMP检测EV71方法的建立和评价

阮美生1，郭龙华2，周天龙1，黎 荣1

(1.湖北科技学院附属第二医院检验科，湖北 咸宁 437100；2.深圳市龙华新区人民医院检验科，广东 深圳 518109）

目的 建立并评价一种简单快速的逆转录环-介导的等温扩增(直接RT-LAMP)检测人肠道病毒71 (EV71)的实验方法。方法无需RNA提取，用热处理标本后用直接RT-LAMP方法检测EV71，并用临床收集的290份咽试标本评价其灵敏度和特异性。结果直接RT-LAMP和RT-LAMP实验完全符合率为92.4% (268/290)，直接RT-LAMP和qRT-PCR完全符合率为88.9%。在RT-LAMP或直接RT-LAMP实验中没有发现假阳性。与RT-LAMP比较，直接RT-LAMP的灵敏度和特异性分别为90.3%和100%；与qRT-PCR比较，其敏感性和特异性分别为86.8%和100%。结论直接RT-LAMP方法能被开发成简单快速检测EV71和其他病原体的方法。

逆转录环-介导的同温扩增；肠道病毒71；实时定量RT-PCR；灵敏度；特异性

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是年幼儿童和婴儿中一种常见的感染性疾病，表现为发热、口腔溃疡和手脚水泡。该疾病主要由人肠道病毒71(Human entrovirus 71，EV 71)和柯萨奇病毒A16 (Coxsackievirus A16，CVA16)引起。HFMD引起严重的公共卫生问题，特别是EV71的感染可导致婴幼儿出现神经性症状，甚至死亡[1-2]。EV71的实验室诊断方法包括病毒分离、病毒特异性抗体的检测和核酸扩增技术检测。EV71的分离培养需要1～2周时间，阳性率较低。检测EV71感染后产生的IgM的酶学技术实验已建立[3-4]，但产生IgM需要一定的时间，难以早期诊断。RT-PCR和实时RT-PCR实验已被报道用于EV71的检测[5-8]，具有高度灵敏度，能检出5个以上病毒RNA Copies/ml或0.1个50%组织培养感染性剂量(TCID50)/ml，但易产生假阳性。以上这些方法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，限制了这些方法在基层医院开展。环介导的等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新颖的恒温核酸扩增方法。与常规PCR相比，LAMP不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，所以，环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。此外，LAMP不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。

在本研究中，我们建立一种检测EV71的直接逆转录的环介导的等温扩增(RT-LAMP)方法，并用临床标本评价直接RT-LAMP方法的灵敏度和特异性。

1 材料与方法

1.1 病毒 6个EV71毒株(HN0803、HN0804、HN0808、AH0806、SD18和SD24)从被证实的HFMD临床咽试或大便标本中分离得到。EV71原型BrCr由北京生物制品所惠赠。CVA16、CVB3和CVB5用于检测RT-LAMP实验的特异性。埃可病毒购自中国科学院武汉病毒研究所，所有病毒都保存在-80℃冰箱。EV71感染RD单层细胞(武汉大学典型物种保存中心)，然后在36℃孵育，直到75%～100%细胞出现细胞病变效应(CPE)。收集细胞上清，并保存在-80℃备用。病毒的滴度采用标准的噬斑实验检测[9]。

1.2 临床标本 于2013年10月至2014年5月，本院儿科门诊根据中国疾控中心HFMD诊断手册对可疑HFMD患者收集290份临床咽试标本，所有这些标本液氮保存备用。

1.3 细胞培养 人RD细胞在含10%胎牛血清(杭州四季青生物技术有限公司)、2 mmol谷氨酰胺、100 IU青霉素和100 μg链霉素/ml的DMEM培养基(Gibco公司)中37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.4 设计EV71-特异的RT-LAMP引物 引物设计参考文献[10]，肠道病毒的VP1基因被用于区别肠道病毒血清型，引物用在线软件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)设计。

1.5 RT-LAMP和qRT-PCR 除了用LoopAmp RNA扩增试剂盒和荧光检测试剂(FDR)(大连宝生物)RT-LAMP 参考文献[11]操作。RT-LAMP反应在Loopamp混浊仪LA-320C(Teramecs，Japan)在65℃孵育45 min。阳性反应定义为样品阈值大于0.2或颜色从橘黄色改变成黄绿色。qRT-PCR实验在ABI Real-Time System 7500 device(Applied Biosystems，USA)操作，用与RT-LAMP等量的病毒RNA的商业qRT-PCR诊断试剂盒(PCR-Fluorescence Probing)检测EV71(金华药业，中国)。每次操作设置阳性和阴性对照，采取措施阻止交叉污染。

1.6 热处理样品的直接RT-LAMP检测 10 μl原始样品和12.5 μl LoopAmp RNA扩增反应混合物(Eiken Chemical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，0.5 μ l无RNase灭菌水和0.5 μl引物(F3和B3:20 pmol/ml；BIP和FIP:120 pmol/ml；Loop-1和Loop-2:60 pmol/ml)；这些混合物在水浴锅95℃30 s，立即放在冰上2 min，然后加入1 μl混合物到反应体系中。除了孵育时间延长到75 min外，直接RT-LAMP操作同上，扩增后加入1 μl 100培稀释的SYBR Green I(Invitrogen，Eugene Oregon，USA)在紫外灯下裸眼观察。颜色从橘黄色变成绿色评判为阳性。

1.7 RT-LAMP和直接RT-LAMP的特异性和敏感性 RT-LAMP通过2 μl提取的EV71参考毒株和各种不同病毒检测其特异性，已滴定的EV7110倍稀释后进行灵敏度分析，而直接的RT-LAMP用10 μl热处理的病毒培养上清进行实验。

2 结果

2.1 直接RT-LAMP实验的优化 直接RT-LAMP实验用细胞培养的病毒为模版确定优化热处理的温度、时间、引物工作浓度以及实验的时间。LAMP扩增在65℃，75 min后检测，把1 μl被稀释的SYBR Green I加到反应管中，阳性(扩增的产物)变绿，所有阴性的对照仍维持原来的橘黄色，即SYBR Green I的起始颜色(图1)。

图1 RT-LAMP实验检测EV71阳性和阴性标本在普通和紫外灯下观察到的颜色

2.2 直接RT-LAMP与RT-LAMP和qRT-PCR方法的比较 用直接RT-LAMP检测从疑似HFMD患者中收集290份热处理的咽试子标本的EV71。同时，将等量的模版RNA用于RT-LAMP和qRT-PCR。直接RT-LAMP和RT-LAMP实验完全符合率为92.4%(268/290)，直接RT-LAMP和qRT-PCR完全符合的为88.9%。在RT-LAMP或直接RT-LAMP实验中没有发现假阳性。与qRT-PCR比较，直接RT-LAMP和RT-LAMP的灵敏度和特异性分别为90.3%和100%、86.8%和100%。

3 讨论

目前临床实验室常见的EV71检测方法有病毒分离培养、ELISA、放免和RT-PCR等，均需要昂贵的仪器设备和训练有素的技术人员，和(或)需要时间长，这些方法不适合基层医院和现场检测EV71。因此，开发一种简单快速检测EV71感染的方法将有助于EV71的早诊断。EV71 RNA提取后用RT-LAMP能快速诊断EV71的感染[12-14]。但RNA提取步骤需要约30 min，省去RNA提取能减少RNA的降解，节省时间，有利于在医院实验室或现场快速诊断EV71的感染。为了减少RT-LAMP检测EV71的费用和时间，我们探索是否能够无需对样品中RNA提取的处理步骤，即用直接RT-LAMP检测EV71。在本研究中，我们采用几种不同的裂解缓冲液可不经过RNA提取步骤的几个预处理方法检测EV71。在我们的研究中，50 μl原始样品(10个EV-71阳性和5个EV-71阴性样品)与100 μl裂解缓冲液A(含5%NP-40，1.5%2-巯基乙醇)，或裂解缓冲液B(含0.1 M Tris-HCl和0.05%Tween 20)，或裂解缓冲液C(含0.1 mol/L Tris-HCl，0.05%Tween 20和0.24 mg/ml蛋白酶K)。在室温孵育15 min后，混合物在75℃水浴5 min，10 μl上清液加入到反应混合物做RT-LAMP。与已报道的DNA病毒的直接LAMP实验检测，如HSV病毒[15]、HHV-6[16-17]和马疱疹病毒1[10]比较，热处理的温度和孵育时间需要优化，可能因为DNA和RNA之间热稳定的巨大差异，特别是RNA病毒基因组含较复杂的二级结构[18]。

为了评估直接RT-LAMP的灵敏度和特异性，收集咽试标本290份，用商业RNA提取试剂盒提取RNA，再用qRT-PCR和RT-LAMP方法检测，比较qRT-PCR、RT-LAMP和直接RT-LAMP对这些标本的检测结果。qRT-PCR和RT-LAMP的总体符合率较好(96.5%一致率)。在258份qRT-PCR阳性的咽试标本中，RT-LAMP实验有24份阴性，直接RT-LAMP阴性66份。qRT-PCR和直接RT-LAMP的差异检测结果是由于直接RT-LAMP的轻微不敏感性，原因如下：加入的样品少(10 μl的原始样品)，样品中病毒滴度低，不同的样品质量(原样品中含潜在扩增抑制剂)。直接RT-LAMP检测无假阳性，在本研究中，直接RT-LAMP实验的临床使用操作简单，对检测的灵敏度和特异性上无显著性危害。此外，在290份咽试标本中，290份热处理的标本也用直接qRT-PCR检测，与qRT-PCR比较，只有约60%的符合率，表明Bst DNA聚合酶比Taq聚合酶在原始样品的扩增中更耐受抑制剂的抑制。

热处理标本准备模版的方法能取代昂贵和费时的RNA分离方法。来自热处理的咽试标本直接扩增后联合浊度实验评估或用SYBR Green I直接观察直接RT-LAMP的扩增产物(大多数在45 min就有阳性反应)。因此该方法能够大量减少检测费用和时间，使其具有潜在的应用价值。

直接RT-LAMP能检测咽试标本中的EV71病毒。热处理的RT-LAMP实验易于操作，所以直接RT-LAMP方法能简单快速检测EV71的感染，有助于早诊断HFMD，以控制HFMD的爆发。但在该方法用于临床诊断EV71感染之前，需要大量不同来源的标本进行评估。

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Development and assessment of direct reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for EV71 detection.

RUAN Mei-sheng1,GUO Long-hua2,ZHOU Tian-long1,LI Rong1.1.Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital,Hubei University of Science and Technology,Xianning 437100,Hubei,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,Shenzhen Longhua New District People's Hospital,Shenzhen 518109,Guangdong,CHINA

Objective To develop a simple and rapid direct reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(direct RT-LAMP)experimental method for detecting enterovirus 71(EV71)infection,and the sensitivity and specificity of this method using clinical nasopharyngeal swab specimens for the detection of EV71 were evaluated.MethodsDirect RT-LAMP without RNA extraction and with heat-treatment was used to detect EV71 infection in 290 nasopharyngeal swab specimens.The sensitivity and specificity were evaluated.ResultsThe accordance rate of direct RT-LAMP and RT-LAMP was 92.4%(268/290),and that of direct RT-LAMP and qRT-PCR was 88.9%.No false positive was found in direct RT-LAMP or RT-LAMP.The clinical performance demonstrated the sensitivity and specificity of direct RT-LAMP was 90.3%and 100%compared to RT-LAMP,and 86.8%and 100%compared to qRT-PCR,respectively.ConclusionDirect RT-LAMP method can potentially be developed for simple and rapid screening of EV71 and other pathogens.

Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP);Enterovirus 71 (EV71);Real-time RT-PCR;Sensitivity;Specificity

R446

A

1003—6350（2015）18—2717—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0986

2015-01-06)

深圳市宝安区科技创新局科技计划项目（编号：2012253）

郭龙华。E-mail：fsgm2399@126.com