Nrf2在百草枯中毒致大鼠急性肺损伤中的表达和意义*

刘振宁，张顺，高嵩岚，郭峰，张红雷，赵敏

（中国医科大学附属盛京医院 急诊科，辽宁 沈阳110004）

百草枯是一种速效高效触杀型除草剂，其安全性高而且对环境无害，在全世界范围内得到广泛使用。我国作为农业大国，是目前世界生产和使用百草枯最多的国家之一。临床上许多患者自杀性口服或者误服百草枯成为百草枯中毒就诊的主要原因。百草枯的中毒致死剂量较小，而且目前尚无特效解毒药物，在临床上病死率极高[1]。由于肺脏中存在着多胺摄取及其转运系统[2]，百草枯结构与其相似，可竞争性抑制聚胺类物质的摄取及聚集，因此，百草枯中毒主要引起急性肺损伤（acute lung injury，ALI），最终导致呼吸衰竭[3]。

百草枯进入机体被肺泡上皮细胞摄取后，发生氧化还原反应，消耗了还原型辅酶Ⅱ（NADPH），并产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），损伤细胞结构并影响其生物学功能[4-5]。转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是机体内重要的抗氧化调节因子，与炎症、衰老、肿瘤等很多疾病关系密切[6]。近年来，国内外学者发现Nrf2参与药物对ALI的保护机制[7-9]，然而Nrf2在百草枯中毒致ALI的过程中所产生的作用，国内未见报道。本研究通过观察和研究Nrf2在百草枯中毒致ALI中的表达，探索Nrf2在此过程中所产生的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百草枯（Sigma，美国），TNF-α 和IL-1β ELISA试剂盒（R&D，美国），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物有限公司，中国），Nrf2抗体（Santa，美国），TBP抗体（Abcam，美国），SABC免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂（武汉博士德生物有限公司，中国），其余均为进口或者国产分析纯化学试剂。

1.2 仪器与设备

显微镜（Olympus，日本），石蜡切片机和石蜡包埋机（Leitz，德国），电泳仪、半干转印仪（BIO-RAD，美国），高速冷冻离心机（Sigma，美国），显微摄像系统（Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本）。

1.3 实验方法

48只雄性SpragueDawley大鼠，体重200～250g，由中国医科大学实验动物中心提供。将大鼠随机平均分成两组，百草枯中毒组按照20mg/kg剂量腹腔注射百草枯；对照组1ml生理盐水腹腔注射。在相同条件下常规饲料饲养，自由取食和饮水，房间温度（25±5）℃、湿度40%～60%，人工照明及黑暗各12h。在腹腔注射百草枯后4、8、24和72 h时，每个时间点各取出6只大鼠，使用10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉。麻醉后将大鼠仰卧于鼠台上固定，常规消毒后打开胸腔，使用5m l注射器刺入右心室，缓慢取血，避免溶血。将血放入10ml离心管中，4℃、3 000 r/min，离心10min，取上清分装至1.5ml EP管中，每管放约0.5ml，置-80℃冰箱保存。心脏采血后，剪掉左心耳，使用生理盐水冲洗肺组织，待清亮液体流出后，完整取出两侧肺组织，观察肺组织颜色、质地、有无出血等病理变化。左肺使用4%多聚甲醛溶液固定，置4℃冰箱中保存；右肺液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

1.4 血清IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活性测定

将收集的大鼠血清在4℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清，按照IL-1β、TNF-α、MDA和SOD试剂盒说明书检测血清中IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活性。

1.5 肺脏湿/干重比值测定

将右肺中叶用生理盐水清洗后，滤纸吸干表面水分，称量肺湿重。然后再把肺叶放入80℃烤箱中48 h后获得肺组织干重，然后以公式计算肺湿/干重比值以评价肺组织水肿程度。计算方法：肺脏湿/干重（W/D）=肺湿重（mg）/肺干重（mg）。

1.6 肺组织损伤评分

取多聚甲醛固定好的大鼠肺组织，切割组织块，至厚度约0.5 cm左右，常规组织梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片，行HE染色。光镜下观察肺组织病理学变化，并按MIKAWA等[10]方法进行肺损伤评分。评分标准如下：①肺泡充血；②出血；③肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；④肺泡壁增厚和/或透明膜形成。分别依据病变轻重评0～4分（0：无病变或非常轻微；1：轻度病变；2：中度病变；3：重度病变；4：极重度病变）。各项评定分数相加为肺组织损伤总评分。

1.7 Western blot检测肺组织核Nrf2的表达

按照细胞核蛋白提取试剂盒说明书，提取肺上皮细胞核蛋白，进行蛋白定量后，加样品缓冲液煮沸5min，各取20μl加样；使用10%聚丙烯酰胺凝胶在150 V、30 mA条件下电泳1.5 h；50 V条件下PVDF膜转膜2 h；5%脱脂牛奶封闭，滴加Nrf2一抗（1︰50），4℃过夜；用含0.1% Tween 20的TBS冲洗5min×3次，再加入二抗（1︰500）室温下孵育2 h，用0.1%TBST冲洗15min×3次，ECL发光检测，X线显影，扫描图像，测得各条带的灰度值，以TBP为内参对照标准后，比较其表达量的变化。

1.8 免疫组织化学染色

将肺组织切片用0.1mol/L PBS漂洗2次，3%H2O2孵育15min，PBS洗3次，3%Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）抗原修复15min，滴加10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭游离的结合位点，室温20min，以减少非特异性染色，倾去切片上血清，滴加1︰500稀释的兔抗鼠Nrf2抗体，4℃冰箱过夜。阴性对照以PBS代替一抗，4℃过夜。PBS洗3次，滴加生物素标记的山羊抗兔二抗工作液（1︰200），室温孵育20min，PBS洗3次，滴加SABC，室温20min。PBS冲洗5min×4次。DAB显色剂显色3min左右，自来水充分冲洗终止显色。苏木素复染30 s，分色，二甲苯透明，晾干。中性树胶封片，显微镜下观察。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析（one-way，ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清MDA、IL-1β、TNF-α 含量和SOD活性测定

百草枯中毒组大鼠血清中MDA、IL-1β 和TNFα 含量随着中毒时间延长而明显增加，血清中SOD活性则明显下降，在中毒1 d时达到最低值（见图1）。

2.2 肺湿/干重比值和肺组织损伤评分

图1 百草枯中毒大鼠血清MDA、IL-1β、TNF-α 含量和SOD活性

百草枯中毒以后，大鼠肺组织逐渐出现水肿充血，肺湿/干重比值（W/D）随着中毒时间延长而逐渐升高，在中毒1和3 d时比较明显（见图2A）。显微镜下所见肺泡结构破坏，肺间质水肿，大量炎症细胞浸润，肺损伤评分明显增加（见图2B）。

2.3 核Nrf2蛋白在肺组织中的表达及蛋白分析

图2 百草枯中毒大鼠肺湿/干重比值和肺损伤评分

核Nrf2在正常肺组织上皮细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞少量表达（见图3A）。在百草枯中毒4和8 h时，核Nrf2在肺组织中表达变化不明显，在中毒1和3 d时表达明显增强（见图3B、C）。Western blot结果表明，核Nrf2在1 d时达到高峰，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；3 d时与对照组比较，虽然有增加的趋势，但是差异无统计学意义（P>0.05）（见图3D）。

图3 核Nrf2蛋白在百草枯中毒大鼠肺组织中的表达和蛋白分析

3 讨论

肺脏作为百草枯作用的主要靶器官，ALI是临床上急性百草枯中毒的主要并发症，临床上表现为进行性呼吸困难和严重低氧血症。百草枯进入机体被肺泡上皮细胞摄取后，消耗大量NADPH，干扰正常呼吸链电子传递，影响生物氧化磷酸化，引起细胞功能衰竭[4]；此外，还原状态的百草枯经微粒体NADPH、细胞色素C还原酶等催化，与分子氧作用形成大量氧自由基包括超氧阴离子O2-、过氧化氢H2O2、羟自由基OH-等，引起膜脂质过氧化反应，不饱和脂肪酸变为饱和脂肪酸，上皮细胞被氧化时生成MDA，使膜成分交联和聚合，破坏膜磷脂结构和功能，最终导致肺泡结构的完整性和通透性发生障碍[5]。ROS的产生还可以激活中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎症细胞，释放炎症细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α 和TNF-β）、白细胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10）等，进一步加重肺组织损伤。本研究结果显示，在百草枯导致大鼠ALI模型中，肺组织W/D比值升高，肺组织病理显示肺泡结构破坏、大量炎症细胞浸润、肺间质水肿，肺组织损伤评分明显增加。同时也发现百草枯中毒后血清中MDA含量增加和抗氧化酶SOD活性降低，说明机体内氧化还原状态失衡。

氧化应激反应是百草枯中毒肺损伤的关键始动环节，在整个过程中起到极其重要的作用。Nrf2是细胞防御氧化应激反应的中枢调节者[11]，在正常情况下，Nrf2通过与胞浆蛋白伴侣分子Keap1在胞浆中结合使其活性处于抑制状态，限制Nrf2迁移至细胞核发挥功能；在氧化应激等条件刺激下，Nrf2与Keap1解偶联，Nrf2产生激活并进入细胞核后与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）结合[12]，即Nrf2/ARE通路，启动下游编码Ⅱ相解毒酶基因和抗氧化蛋白的转录[13]，如NAD（P）H醌氧化还原酶1（quinone oxidoreductase，NQO1）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）[14]、过氧化氢酶（catalase，CAT）、SOD[15]、血红素氧合酶-1（heme oxygen synthase-1，HO-1）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等[16]，有助于维持机体内氧化还原平衡。

研究表明，目前很多呼吸系统疾病包括慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、哮喘、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）均与Nrf2有关。将Nrf2基因敲除的小鼠长期暴露于烟雾中，可以引起更严重的肺气肿症状，体内抗氧化酶表达明显减少，细胞凋亡数量明显增加[17]。高氧状态下，与野生型小鼠相比较，Nrf2-/-小鼠肺通透性增加，炎症细胞浸润，上皮细胞损伤严重，Nrf2下游的多种抗氧化酶（如GST、NQO1和HO-1）的表达明显减少[18]。在高潮气量机械通气引起的呼吸机相关性肺损伤（ventilator induced lung injury，VILI）小鼠研究中，也有类似发现，Nrf2-/-小鼠肺泡、血管通透性和炎症因子水平升高，ARE反应性谷胱甘肽合成酶水平减少，氧化还原平衡受到破坏[19]。Nrf2在颅脑损伤所致的ALI中同样发挥着重要的调节作用，Nrf2-/-小鼠炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）表达增多，抗氧化和解毒酶（NQO1、GST）明显减少[20]。有学者研究[21]发现，多酚表儿茶素酸酯活化Nrf2/ARE通路反应可以减轻博来霉素诱导的大鼠肺损伤和纤维化，巨噬细胞和中性粒细胞产生的活性氧形成氧化性环境，导致Nrf2激活及其下游基因表达增加[22]。

本研究结果显示，正常大鼠肺组织表达少量水平的Nrf2蛋白，免疫组织化学结果显示正常大鼠肺组织Nrf2主要位于肺泡上皮细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞。在百草枯导致肺组织损伤1 d时，Nrf2蛋白明显增加，3 d时有所下降。Nrf2表达增加可能与百草枯激活体内氧化应激系统有关，使得Nrf2与Keap-1解离并进入细胞核内，激活下游的抗氧化酶，产生保护作用。有学者采用重组腺病毒载体Nrf2转染百草枯作用下的A549肺上皮细胞，发现炎症细胞因子、氧化应激因子以及凋亡相关因子均有不同程度的降低[23]。这与本研究结果相似，均提示Nrf2参与了百草枯导致ALI的过程，产生内在的保护作用。

总之，本研究结果表明，Nrf2参与了机体内在的保护作用，Nrf2有望成为治疗百草枯中毒新的靶点。如果能使Nrf2表达增强则可以减轻百草枯的毒性反应，从而对百草枯所引起的ALI产生保护作用，具有良好的临床应用前景。

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