夏季太湖梅梁湾水体中细菌的群落结构

徐超，张军毅，朱冰川，宋挺，黄君，吴蔚

(无锡市环境监测中心站， 江苏 无锡 214121)



夏季太湖梅梁湾水体中细菌的群落结构

徐超，张军毅*，朱冰川，宋挺，黄君，吴蔚

(无锡市环境监测中心站， 江苏 无锡 214121)

利用高通量测序技术，选择16S rRNA V6区作为目标片段，对夏季太湖梅梁湾水体中的细菌群落结构进行了分析，结果表明，共产生了101 427条优质序列，细菌为100 935条，占99.5%；在蓝藻暴发期间，共检测到14门，55属，610个操作分类单位。优势门类为蓝藻门(39.7%)，放线菌门(27.2%)和变形菌门(23.4%)，微囊藻属(21.0%)和聚球藻属(15.9%)为主要优势种。

高通量测序；群落结构；16S rRNA；太湖

2007年无锡市发生“供水危机”之后，太湖不但成为国际关注的焦点，更是成为大型浅水富营养化湖泊研究的典范[1-12]。近年来，蓝藻水华的持续暴发和最大聚集面积有冬季后移的倾向，表明蓝藻水华监测及其治理的复杂性和艰巨性。

细菌在微食物网的能量流动和物质循环起着关键性作用，在全球性水体富营养化进程中，随着摄食食物链的变细与变短，以及微生物环的持续增粗，细菌在湖泊生态系统中的地位和作用显著增加。目前基于营养盐、气象等研究蓝藻水华暴发的很多[2,13-17]，而基于细菌来探索蓝藻水华暴发机制的并不是很多[18-19]。

现利用高通量测序技术，研究蓝藻水华暴发期间的细菌多样性和群落结构，以期为后续研究蓝藻水华和细菌的相互关系、以及探索蓝藻水华的暴发机制提供参考。

1 研究方法

1.1 样本采集及其V6区扩增

样品采自2013年8月23日太湖梅梁湾，取2 L表层水样，用0.22 μm微孔滤膜富集，后立即-20 ℃冷冻。回实验室后即进行DNA提取，采用E.Z.N.A.® Water DNA Kit(OMEGA,USA)。用Nano Drop ND 1000(Thermo Scientific,DE,USA)进行定量分析。V6 目标区的扩增，共27个循环，反应条件如下。预变性：94 ℃,5 min，变性：94 ℃,30 s，退火：50 ℃,30 s，延伸：72 ℃,30 s,最后72 ℃,5 min。为了避免引物扩增的偏向性，采用针对细菌16S rRNA的融合引物。上游引物：967F-PP 5′-CNACGCGAAGAACCTTANC-4′,967F-UC1 5′-CAACGCGAAAAACCTTACC-4′,967F-UC2 5′-CAACGCGCAGAACCTTACC-4′,967F-UC4 5′-ATACGCGARGAACCTTACC-4′,967F-AQ 5′-CTAACCGANGAACCTYACC-4′。下游引物：1046R 5′-CGACAGCCATGCANCACCT-4′,1046R-PP 5′-CGACAACCATGCANCACCT-4′,1046R-AQ1 5′-CGACGGCCATGCANCACCT-4′。

1.2 测序及其数据处理

采用Illumina MIseq PE250测序平台。数据分析可以包含以下流程。首先，初步质量过滤：步长为 1 的5 bp窗口从第一个碱基位置开始移动，窗口中碱基平均质量>Q20，从第一个150；然后，用软件 Flash连接通过质量过滤的序列。然后，对连接上的序列通过 index 完全匹配得到每个样品的有效序列。其次，去除嵌合体得到优质序列：通过mothur软件中 uchime的方法去除嵌合体序列。并通过Qiime以下规则进行第二次过滤：5′端前引物检查，允许最大错配数1去；除模糊碱基数>0、单碱基高重复区>8 bp以及长度<200 bp 的序列[20]。最后，OTU列表生成及注释，及其过滤后的有效序列：在 Qiime 中调用 uclust的方法对优质序列按相似度0.97进行聚类，选取每个类最长的序列为代表序列。然后再在Qiime中调用 RDP-classifie的方法，以GG 数据库(13.5)的序列为训练集，对 OTU 代表序列进行注释；采用 blast的方法对序列数据库进行比对，获得每个 OTU 分类学信息。将原始 OTU按照0.005%的标准进行精简以去除可信度较低的序列[21-22]，所得数据进行下一步分析。

2 结果讨论

2.1 测序结果统计

Illumina Miseq PE250测数的数据概要见表1。

表1 测序数据概要①

①有效序列为双端有效拼接后序列；优质序列为去除嵌合体序列；过滤序列为执行0.005%的过滤标准后过滤序列

由表1可见，通过有效拼接、去嵌合体和过滤，可以获得101 427条，平均长度为79的序列(去除了引物)。执行0.005%的过滤标准，去掉<6以下的序列后，共总去掉了18 214条序列，去除滤为15.2%。注解结果中，并未发现古细菌，表明融合引物的特异性较好。仅发现了492条没有比对上的序列，所占比列为0.5%，可见V6区对太湖夏季水体的细菌群落具有较好的识别力。

2.2 细菌群落特征

V6区对于细菌物种的鉴定在门、纲、目、科、属、种等6个分类水平上表现出差异。在门水平上100 935条序列，100.0%可以注解，但到了属水平上，仅有43.5%序列可以注解。物种鉴定的效率是随着分类水平下降呈明显下降趋势，见表2。

表2 各分类水平上的OTUs、个数和序列数

由表2可见，获得了100 935条过滤后的优质细菌序列，隶属于蓝藻门,39.7%；放线菌门,27.3%；变形菌门,23.4%；疣微菌门Verrucomicrobia,2.5%；绿菌门Chlorobi,2.2%；拟杆菌门Bacteroidetes,2.1%；绿弯菌门Chloroflexi,1.1%；浮霉菌Planctomycetes,0.6%；酸杆菌门Acidobacteria,0.5%；芽单胞菌门Gemmatimonadetes,0.4%；厚壁菌门Firmicutes,0.3%；软壁菌门Tenericutes,0.01%；GN02,0.01%；装甲菌门Armatimonadetes,0.01%等14门。其中，优势门类为蓝藻门，放线菌门和变形菌门，合计90.4%。蓝藻门在丰度方面占具明显优势，这主要体现在水体中的微囊藻Microcystis spp.(21.0%)。通过对同步浮游植物样本的显微镜观察分析，微囊藻的优势度高达95.4%。

14门共鉴定了610个OTUs。隶属于变形菌门，42.5%；蓝藻门，16.6%；放线菌门，15.2%；拟杆菌门，9.5%；疣微菌门，4.8%；浮霉菌，3.6%；绿菌门，2.0%；酸杆菌门，2.0%；绿弯菌门，1.1%；芽单胞菌门，1.1%；厚壁菌门，1.1%；软壁菌门，0.2%；GN02，0.2%；装甲菌门，0.2%等14门。其中，优势门类为蓝藻门，放线菌门和变形菌门，合计74.3%。

在属水平上，共鉴定55属，183个分类单元。其中值得关注的是微囊藻属21 162条序列，12个OTUs和聚球藻属16 053条序列，22个OTUs。微囊藻属和聚球藻属序列分别占属水平的21.0%，15.9%， OTUs分别占6.6%，28.4%。

文献[23]通过DGGE的手段对中国富营养化湖泊，太湖和巢湖的细菌群落结构研究表明，在富营养化水平较高的地方，微囊藻占优势种，而在一些藻类生物量较低的地方聚球藻占优势种。除此之外，太湖水体蓝藻门还发现有拟浮丝藻属Planktothricoides、束丝藻属Aphanizomenon、细鞘丝藻属Leptolyngbya、长胞藻属Dolichospermum、颤藻属Oscillatoria和假鱼腥藻属Pseudanabaena等6个常见种类，与光学显微镜观察的结果一致，见表3。

表3 属水平上的种类明细①

续表

①*为蓝藻门；A为高丰度(reads数>10 000) ；B为中丰度(100

3 结论

太湖蓝藻水华暴发期间，共检测到14门，55属，610个OTUs。细菌群落结构特征较为明显，主要优势门类为蓝藻门(39.7%)，放线菌门(27.2%)和变形菌门(23.4%)，3门共计90.4%。在属水平上，微囊藻属(21.0%)和聚球藻属(15.9%)为主要优势种。此外，假鱼腥藻在微囊藻胶被中大量存在的现象也被证实。

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《环境监控与预警》编辑部

Extensive Profiling of a Bacterial Community during Summer in Meiliang Bay,Lake Taihu

XU Chao,ZHANG Jun-yi*,ZHU Bing-chuan,SONG Ting,HUANG Jun,WU Wei

(WuxiEnvironmentalMonitoringCentralStation,Wuxi,Jiangsu214121,China)

In order to explore the prokaryotic community during summer in Meiliang Bay,Lake Taihu, we performed high-throughput sequencing of the 16S rRNA genes V6 hypervariable regions. The results showed that a total of 101 427 quality reads (bacterial reads 100 935, 99.5%) were obtained.Bacteria were found belonging to 14 phyla, 55 genera, and 610 OTUs. At the phylum level, the bacterial community composition was predominated byCyanobacteria(39.7%),Actinobacteria(27.2%),Proteobacteria(23.4%). At the genus level,Microcystis(21.0%) andSynechococcus(15.9 %) was the most abundant genus.

High-throughput sequencing; Community structure; 16S rRNA; Lake Taihu

2014-10-11；

2014-12-23

江苏省环境监测科研基金资助项目(1320)。

徐超(1986—)，女，助理工程师，硕士，主要从事水域生态学研究。

*通讯作者：张军毅 E-mail：blocksharon@163.com

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1674-6732(2015)01-0037-04